PPENK-MIDGE-NLS转染白细胞减轻心肌缺血再灌注损伤

发布时间：2017-05-25 15:29

  本文关键词：PPENK-MIDGE-NLS转染白细胞减轻心肌缺血再灌注损伤，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:心肌缺血再灌注损伤是临床的棘手难题,大量实验表明心肌缺血预处理/后处理是对抗该损伤的重要机制,而脑啡肽可以模拟该机制从而产生显著的心肌保护作用。但阿片类药物用于心肌保护受到诸多限制,基因治疗是增加内源性脑啡肽的一种有前景的研究方向,本课题构建的前脑啡肽原(Preproenkephalin,PPENK)PPENK-MIDGE-NLS基因载体克服了病毒载体和质粒载体的缺点,利用其转染免疫细胞,使其于心肌损伤区域靶向释放内源性脑啡肽,对心肌产生保护作用,并探索一种新的预防和治疗心肌缺血再灌注损伤的新方法。方法:利用非病毒、非质粒的微量免疫原定义的基因表达(Minimalistic Immunological defined gene expression,MIDGE)方法构建前脑啡肽原PPENK-MIDGE-NLS基因载体,静脉注射转染白细胞,利用白细胞向缺血区聚集、浸润的特性,在损伤区域持续产生、靶向释放内源性脑啡肽。流式细胞术证实转染效果,分子生物、免疫组化和放射免疫法测定PPENK-MIDGE-NLS对心肌局部脑啡肽前体、脑啡肽及其代谢产物基因表达和含量的影响,结合心肌功能、梗死面积的测定及心肌酶谱和炎性因子的变化,评价PPENK-MIDGE-NLS基因载体减轻心肌缺血再灌注损伤的可行性、有效性及对炎性反应的调节作用。结果:1、利用生物化学方法成功构建PPENK-MIDGE-NLS基因载体;2、PPENK-MIDGE-NLS基因载体局部注射时可以转染活体细胞并增加局部PENK蛋白的表达量,静脉注射时可以转染白细胞并发生心肌浸润;3、大鼠心肌缺血再灌注损伤时静脉注射PPENK-MIDGE-NLS基因载体能够改善大鼠血流动力学指标,心肌梗死面积减小,CK-MB活性较对照组下降,心肌细胞坏死程度较对照组减轻,心肌细胞凋亡指数显著低于对照组(P0.05)。结论:前脑啡肽原PPENK-MIDGE-NLS基因载体能够转染大鼠白细胞,在大鼠发生心肌缺血再灌注损伤时于损伤处心肌靶向释放内源性脑啡肽,对心肌具有保护作用。
【关键词】：心肌缺血再灌注损伤 脑啡肽 基因载体 白细胞
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R542.2
【目录】：

• 缩略语表5-8
• 中文摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 前言12-13
• 文献回顾13-18
• 实验一 PPENK-MIDGE-NLS基因载体的构建18-36
• 1 材料18-22
• 1.1 主要仪器18-19
• 1.2 主要试剂及耗材19-20
• 1.3 试剂配制20-21
• 1.4 质粒及菌株21-22
• 2 方法22-31
• 2.1 重组质粒pEGFP-N1-PPENK的构建22
• 2.2 NLS与基因载体的连接22-25
• 2.3 MIDGE表达框25-29
• 2.4 PPENK-MIDGE-NLS基因载体的构建29-31
• 3 结果31-34
• 3.1 ODN1与NLS的连接31
• 3.2 HPLC对ODN1-NLS连接产物的检测31-32
• 3.3 MIDGE表达框的获得32-33
• 3.4 PPENK-MIDGE-NLS基因载体33-34
• 4 讨论34-36
• 实验二 PPENK-MIDGE-NLS基因载体对活体细胞的转染36-51
• 1 材料36-41
• 1.1 主要仪器36-37
• 1.2 主要试剂及耗材37
• 1.3 试剂配制37-41
• 1.4 实验动物41
• 2 方法41-45
• 2.1 局部注射PPENK-MIDGE-NLS基因载体的转染效果41-43
• 2.2 静脉注射PPENK-MIDGE-NLS基因载体的转染效果43-45
• 3 结果45-49
• 3.1 PPENK-MIDGE-NLS基因载体局部注射对活体细胞的转染效果45-47
• 3.2 静脉注射基因载体对白细胞的转染47-49
• 4 讨论49-51
• 实验三 PPENK-MIDGE-NLS基因载体减轻心肌缺血再灌注损伤51-62
• 1 材料51-52
• 1.1 主要仪器51-52
• 1.2 主要试剂及耗材52
• 1.3 试剂配制52
• 1.4 实验动物52
• 2 方法52-55
• 2.1 心肌缺血再灌注损伤模型的建立52-53
• 2.2 PPENK-MIDGE-NLS基因载体对损伤心肌的保护作用53-55
• 3 结果55-60
• 3.1 血流动力学改变55-57
• 3.2 心肌酶谱的改变57
• 3.3 心肌梗死面积的变化57-58
• 3.4 基因载体在心肌组织的表达58-59
• 3.5 心肌凋亡半定量分析59-60
• 3.6 心肌损伤区域PENK蛋白表达量的改变60
• 4 讨论60-62
• 小结62-64
• 参考文献64-67
• 个人简历和研究成果67-68
• 致谢68

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  本文关键词：PPENK-MIDGE-NLS转染白细胞减轻心肌缺血再灌注损伤，由笔耕文化传播整理发布。

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