可再生附属器官的基因活性皮肤再生材料构建及性能研究

发布时间：2017-07-18 22:02

  本文关键词：可再生附属器官的基因活性皮肤再生材料构建及性能研究

  更多相关文章： HGF SDF-1 基因活性 人工皮肤替代物 附属器官

【摘要】：皮肤附属器官的再生是皮肤组织修复与再生功能化的重要标志之一。尽管目前商业化的人工皮肤替代物能够实现表皮和真皮的结构性修复,但皮肤附属器官仍然缺失。为了在表皮和真皮组织修复的同时实现毛囊再生,以基因工程方法,将目的基因导入质粒,制备肝细胞生长因子质粒DNA (HGF-pDNA),实现对目的蛋白HGF的持续表达。以骨髓间充质干细胞(BMSCs)为种子细胞,制备负载BMSCs的基因活性胶原-壳聚糖支架材料(GASM)。将脂质体(LipofectamineTM 2000)与pDNA利用静电作用形成纳米粒子来保护pDNA,将纳米粒子导入胶原-壳聚糖支架,得到基因活性支架(GAS),激光共聚焦显微镜(CLSM)及扫描电子显微镜(SEM)显示纳米粒子能够均匀分散在支架中,并良好粘附在孔壁表面。将BMSCs种植到支架中,Western Blotting结果显示,相对于空白支架,GAS能够极大促进目的蛋白HGF的表达。利用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)及Western Blotting对基因活性支架中毛囊特征因子多功能蛋白聚糖(Versican)、碱性磷酸酶(ALP)、Ⅳ型胶原(COL IV)分析显示,三种信号因子在基因和蛋白水平的表达都较空白支架高,表明BMSCs被GAS诱导向毛囊定向分化。以负载BMSC的空白支架(BSM)和HGF-pDNA GAS为对照组,将实验组GASM植入SD大鼠的背部全层皮肤损伤模型中。大体观察结果发现,实验组能够在再生表皮与真皮组织的同时,实现毛发的再生。对10 d、21 d和35 d的组织切片HE染色分析发现,在10 d时可见松散的团状类毛囊结构,而21d和35 d时这种结构逐渐成熟。为鉴定再生类毛囊结构,对再生组织进行免疫组化(IHC)分析发现,再生类毛囊结构呈现Versican、ALP和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)阳性,表明再生类毛囊结构具有毛囊特征。对其进行RT-qPCR及Western Blotting分析显示,相对于对照组,实验组10 d时在Versican、ALP和α-SMA因子蛋白及基因水平的表达都较高。将雄性大鼠的BMSCs作为种子细胞植入雌性体内,采用Y染色体原位杂交的方法鉴定再生毛囊结构细胞来源,发现在10 d时部分细胞呈现Y染色体阳性,而在21 d时阳性细胞比例急剧下降,表明植入的外源性BMSCs与自体细胞共同参与再生组织毛囊结构的重建。为了实现原位诱导再生,在不加入BMSCs的GAS中引入SDF-1,以期其能够诱导自体干细胞参与毛囊再生。我们将合成的磺化壳聚糖(OCS)与聚赖氨酸(PLL)和基质细胞衍生因子-1(SDF-1)结合成复合粒子,酶联免疫吸附测定试剂盒(ELISA)测定结果显示复合粒子对生长因子的负载率达到63.01%,在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中,168 h时对SDF-1的释放比率约为40%,有效实现对SDF-1的控制释放。体内实验结果显示35 d时,负载SDF-1的基因活性支架能够再生出类毛囊囊状结构,而不含SDF-1复合粒子的基因活性支架则不能再生类毛囊囊状结构。
【关键词】：HGF SDF-1 基因活性 人工皮肤替代物 附属器官
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R318.08
【目录】：

• 致谢5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 1 引言13-31
• 1.1 组织工程与再生医学13-19
• 1.1.1 组织工程与再生医学概述13
• 1.1.2 组织工程与再生医学支架材料设计13-15
• 1.1.3 组织工程与再生医学支架材料的选择15-16
• 1.1.4 组织工程与再生医学支架的形式16-18
• 1.1.5 支架材料的生物活性化18-19
• 1.2 皮肤再生与皮肤替代物19-23
• 1.2.1 皮肤修复的生理过程19-20
• 1.2.2 人工皮肤替代物的需求与发展20-22
• 1.2.3 人工皮肤替代物的主要问题22-23
• 1.3 皮肤附属器官再生意义23-27
• 1.3.1 皮肤附属器官发育的生理过程24-25
• 1.3.2 皮肤附属器官再生种子细胞25-26
• 1.3.3 皮肤附属器官再生因子26-27
• 1.3.4 皮肤附属器官再生材料体系27
• 1.4 基因工程27-29
• 1.4.1 基因工程概述27-28
• 1.4.2 基因传递体系28
• 1.4.3 基因活性支架材料28-29
• 1.5 课题提出29-31
• 2 基因活性支架的制备及其体外性能评价31-45
• 2.1 实验部分31-38
• 2.1.1 主要原料与试剂31-33
• 2.1.2 胶原的提取33
• 2.1.3 大鼠骨髓间充质干细胞的提取及培养33-34
• 2.1.4 胶原结构表征34
• 2.1.5 胶原-壳聚糖支架制备34
• 2.1.6 HGF-pDNA/liposome复合纳米粒子制备34
• 2.1.7 复合粒子形貌表征34
• 2.1.8 复合粒子粒径分析34-35
• 2.1.9 GAS制备35
• 2.1.10 复合粒子在支架中分布35
• 2.1.11 GASM制备35
• 2.1.12 GAS表面形貌分析35
• 2.1.13 体外HGF的表达35-37
• 2.1.14 GAS体外诱导BMSCs分化性能研究37-38
• 2.2 提取胶原表征38-39
• 2.3 HGF-pDNA/liposome复合粒子表征39
• 2.4 GAS的表面形貌39-40
• 2.5 GAS细胞相容性40-41
• 2.6 GAS中细胞对目的蛋白的表达41-42
• 2.7 GAS诱导BMSCs毛囊定向分化42-44
• 2.8 本章小结44-45
• 3 基因活性支架诱导毛囊再生的体内评价实验45-61
• 3.1 实验部分46-49
• 3.1.1 主要原料与试剂46
• 3.1.2 动物实验模型46-47
• 3.1.3 毛囊再生效果的大体观察与统计结果分析47
• 3.1.4 组织学观察47
• 3.1.5 毛囊结构鉴定47-48
• 3.1.6 再生毛囊来源的鉴定48-49
• 3.1.7 皮脂腺的鉴定49
• 3.2 动物实验模型49-50
• 3.3 伤口修复过程的观察50-51
• 3.4 伤口修复效果的观察51-52
• 3.5 再生毛囊结构细胞来源的鉴定52-54
• 3.6 再生组织中诱导因子HGF基因及蛋白水平的表达54
• 3.7 毛囊结构的H&E染色54-56
• 3.8 类皮脂腺结构的鉴定56
• 3.9 再生毛囊结构的免疫组化分析56-57
• 3.10 再生组织相关因子基因蛋白水平的表达57-59
• 3.11 本章小结59-61
• 4 复合募集因子的基因活性支架诱导毛囊再生体系61-73
• 4.1 实验部分62-64
• 4.1.1 主要原料与试剂62
• 4.1.2 磺化壳聚糖的制备62
• 4.1.3 磺化壳聚糖结构表征62-63
• 4.1.4 OCS/PLL/SDF-1复合纳米粒子的制备63
• 4.1.5 OCS/PLL/SDF-1复合纳米粒子粒径与电位63
• 4.1.6 负载SDF-1复合粒子的支架的制备63
• 4.1.7 SDF-1体外释放行为63
• 4.1.8 SDF-1包封率的测定63
• 4.1.9 SDF-1活性的保护63-64
• 4.1.10 动物实验模型64
• 4.1.11 附属器官再生效果分析64
• 4.2 磺化壳聚糖的结构表征64-65
• 4.3 OCS/PLL/SDF-1复合粒子的粒径和表面电位65
• 4.4 OCS/PLL/SDF-1复合粒子对SDF-1包封率65-66
• 4.5 OCS/PLL/SDF-1复合粒子对SDF-1释放66-67
• 4.6 OCS/PLL/SDF-1复合粒子对SDF-1保护性能67-68
• 4.7 OCS/PLL/SDF-1复合粒子对BMSCs的诱导迁移性能68-69
• 4.8 OCS/PLL/SDF-1的细胞毒性69-70
• 4.9 动物实验模型70-71
• 4.10 原位诱导毛囊再生性能71-72
• 4.11 本章小结72-73
• 全文总结73-75
• 参考文献75-87
• 作者简介87

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