肝郁脾虚证大鼠肠道钠尿肽信号通路的变化及逍遥散的干预作用

发布时间：2017-08-09 13:31

  本文关键词：肝郁脾虚证大鼠肠道钠尿肽信号通路的变化及逍遥散的干预作用

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【摘要】：目的:肝郁脾虚证是中医肝郁和脾虚的复合证。为郁怒伤肝,肝失疏泄,气机郁结,肝郁则横逆犯脾,脾失健运而致。临床观察显示肝郁脾虚证患者存在不同程度的胃肠运动障碍。研究表明肝郁脾虚证胃肠运动障碍与神经递质、激素和细胞因子分泌异常密切相关。钠尿肽(Natriuretic Peptides,NPs)是共存于神经系统和胃肠道的肽类激素,通过与细胞膜上的钠尿肽受体(Natriuretic Peptide Receptors,NPRs)结合,发挥着利尿、排钠、舒张血管、调节血压等作用。众多研究表明钠尿肽及其相应受体广泛分布于胃肠道,并且可作为局部调质以自分泌和旁分泌的方式对胃肠运动发挥抑制作用。NPs抑制胃肠平滑肌收缩活动主要是通过NPs-NPRs-pGC-cGMP-PKG信号转导途径实现的。然而,肝郁脾虚证引起的胃肠运动障碍的发生发展过程中NPs-NPRs-pGC-cGMP信号转导途径是否起重要的作用,逍遥散改善肝郁脾虚证引起的胃肠运动障碍与NPs信号通路之间的关系尚不清楚。因此,本研究通过慢性温和不可预知性刺激(Chronic Unpredictable Mild Stress,CUMS)结合孤养的方法制造肝郁脾虚证大鼠模型,并对大鼠施以不同剂量逍遥散、米氮平干预治疗,在组织水平、分子水平上探讨NPs-NPRs-pGC-cGMP信号转导途径各关键环节在肝郁脾虚证大鼠空肠、结肠、直肠组织中的变化情况及逍遥散的干预机制。本研究共从以下四部分进行探讨:本部分通过慢性温和不可预知性刺激结合孤养的方法制造肝郁脾虚证大鼠模型,并对大鼠施以不同剂量逍遥散、米氮平干预治疗。将清洁级的健康雄性大鼠随机分为正常组、模型组、逍遥散高、中、低剂量组、米氮平组,每组9只大鼠。除了正常组大鼠每笼三只饲养以外,其余组大鼠每笼一只孤养。正常组大鼠自由活动,不限制饮水饮食。用不同刺激因子交替持续刺激各治疗组及模型组大鼠。逍遥散治疗组和米氮平治疗组大鼠分别在接受刺激一小时前用不同剂量逍遥散、米氮平水溶液灌胃处理。正常组与模型组大鼠用生理盐水灌胃,造模实验持续四周,灌胃处理持续六周。逍遥散高、中、低剂量分别为30.6g/kg2d、15.3g/kg2d、7.65g/kg2d;米氮平剂量为10mg/kg2d。每周定期观察各组大鼠一般状态及旷场实验等行为学表现、测量大鼠体重及尿d-木糖排泄率。结果:(1)大鼠的一般状态观察结果显示造模结束时模型组大鼠神态倦怠、毛发枯黄散乱无光泽、胡须下垂、目色暗红、吱吱细叫,扎堆或蛰伏在角落、大便多稀溏。(2)模型组大鼠体重增长最为缓慢,米氮平组大鼠体重增长最快。逍遥散剂量依赖性地改善大鼠体重增长缓慢的情况。四周后,正常组、米氮平组及逍遥散高、中剂量组大鼠体重与模型组之间差异显著(n=9,##p0.01)。(3)在旷场实验中的穿格次数、站立次数、修饰次数三个行为学指标中,模型组大鼠次数减少最多,米氮平组大鼠次数略有减少。逍遥散剂量依赖性地抑制旷场实验中三个指标次数减少的情况。四周后,正常组及各治疗组与模型组大鼠之间差异显著(n=9,##p0.01)。(4)尿d-木糖排泄率结果显示模型组大鼠排泄率降低幅度最大,正常组大鼠排泄率基本不变。逍遥散剂量依赖性地改善尿d-木糖排泄率降低的情况。米氮平组大鼠排泄率略有降低。四周后,正常组及各治疗组与模型组之间差异显著(n=9,##p0.01)。第二部分:肝郁脾虚证大鼠肠道nps的表达变化及逍遥散、米氮平的干预作用方法:本部分利用免疫组织化学技术观察心房钠尿肽(atrialnatriureticpeptide,anp)、c型钠尿肽(c-typenatriureticpeptide,cnp)在大鼠空肠、结肠、直肠组织中分布及表达情况;利用real-timepcr技术检测anp、cnp的mrna表第一部分:肝郁脾虚证大鼠模型制备及逍遥散、米氮平的干预作用方法:达量差异。结果:(1)大鼠腹腔解剖所见胃肠情况显示模型组大鼠腹腔内有渗出液、胃肠极度扩张、胃肠内滞留大量内容物及气体、伴有酸腐刺鼻气味、尤其是盲肠部位尤为严重,肠道黏膜充血肿胀、血管突出、肠壁水肿变薄、肠道蠕动非常差。正常组大鼠胃肠形态正常,肠黏膜呈粉红色、肠壁无水肿粘连,内容物较少,胃肠蠕动正常。(2)利用免疫组织化学技术观察到anp、cnp免疫阳性细胞有棕黄色颗粒沉淀,主要分布于大鼠肠道的黏膜层和肌层。anp、cnp阳性染色定位于平滑肌细胞,基底颗粒细胞和基质细胞的细胞核及胞浆中。各组大鼠肠道肌层和黏膜层均表达anp、cnp,但各组之间表达量有差异。正常组及各治疗组大鼠肠道anp、cnp的表达量低于模型组,且差异显著(n=9;##p0.01);米氮平治疗组与逍遥散高剂量组相比,anp、cnp的表达量并无显著差异。逍遥散剂量依赖性地抑制anp、cnp的表达。anp在空肠的表达量最多,cnp在直肠的表达量最多。(3)利用real-timepcr检测anp、cnp的mrna含量,结果显示各组大鼠空肠、结肠、直肠均表达anp、cnp的mrna,但是表达量有差异。anp、cnp的mrna表达量趋势与其免疫组织化学结果趋势一致。第三部分:肝郁脾虚证大鼠肠道内nprs表达变化及逍遥散、米氮平的干预作用方法:本部分利用免疫组织化学技术观察钠尿肽a型受体(natriureticpeptidereceptora,npr-a)、钠尿肽b型受体(npr-b)、钠尿肽c型受体(npr-c)在大鼠空肠、结肠、直肠组织中分布及表达情况;利用real-timepcr及westernblot检测npr-a、npr-b、npr-c的mrna、蛋白表达量差异。结果:(1)利用免疫组织化学技术观察到npr-a、npr-b、npr-c免疫阳性细胞有棕黄色颗粒沉淀,主要表达于大鼠肠道各组织的黏膜层和肌层。npr-a、npr-b、npr-c阳性染色定位于平滑肌细胞,基底颗粒细胞和基质细胞的细胞膜上。各组大鼠空肠、结肠、直肠组织的肌层和黏膜层均表达npr-a、npr-b、npr-c,但各组之间表达量有差异。正常组、米氮平组、逍遥散高剂量组、逍遥散中剂量组npr-a、npr-b、npr-c的表达量低于模型组,且差异显著(n=9;##p0.01);米氮平治疗组与逍遥散高剂量组相比,npr-a、npr-b、npr-c的表达量并无显著差异。逍遥散剂量依赖性地抑制npr-a、npr-b、npr-c的表达。npr-a、npr-c在空肠的表达量最多,npr-b在结肠的表达量最多。(2)利用real-timepcr检测npr-a、npr-b、npr-c的mrna含量,结果显示各组大鼠空肠、结肠、直肠均表达npr-a、npr-b、npr-c的mrna,但是各组表达量有差异。npr-a、npr-b、npr-c的mrna含量趋势与其免疫组织化学结果趋势一致。(3)westernblot结果显示各组大鼠空肠、结肠、直肠均表达npr-a、npr-c蛋白,但是各组表达量有差异。npr-a、npr-c的蛋白表达趋势与其免疫组织化学结果趋势一致。第四部分:肝郁脾虚证大鼠胃肠激素及cgmp含量变化方法:本部分利用elisa(enzymelinkedimmunosorbentassay,酶联免疫吸附剂测定)检测大鼠血清中胃泌素(gastrin,gas)、抑胃肽(gastricinhibitorypolypeptide,gip)含量的变化及大鼠血清及结肠组织匀浆液中cgmp含量变化。结果:(1)正常组及各治疗组大鼠血清中胃泌素的含量均高于模型组,且差异显著(n=9;##p0.01)。米氮平组与逍遥散高剂量组相比,胃泌素含量并无显著差异。逍遥散剂量依赖性促进胃泌素的合成分泌。(2)正常组及各治疗组大鼠血清中抑胃肽的含量均低于模型组,且差异显著(n=9;##p0.01)。米氮平组与逍遥散高剂量组相比,抑胃肽含量并无显著差异。逍遥散剂量依赖性抑制抑胃肽的合成分泌。(3)正常组及各治疗组大鼠血清中cgmp的含量均低于模型组,且差异显著(n=9;##p0.01)。逍遥散高剂量组与中剂量组相比,cgmp的含量并无显著差异。逍遥散剂量依赖性抑制cgmp生成。(4)正常组及各治疗组大鼠结肠中cgmp的含量均低于模型组,且差异显著(n=9;##p0.01)。逍遥散高剂量组与中剂量组、米氮平组相比,cgmp的含量并无显著差异。逍遥散剂量依赖性抑制cgmp生成。结论:(1)ANP、CNP存在于大鼠肠道黏膜层的基底颗粒细胞、基质细胞及肌层的平滑肌细胞的胞核及胞浆中。NPR-A、NPR-B、NPR-C存在于大鼠肠道黏膜层的基底颗粒细胞、基质细胞及肌层的平滑肌细胞的细胞膜上。(2)NPs-NPRs-pGC-cGMP信号通路上调可能是肝郁脾虚证大鼠胃肠运动障碍的原因之一,米氮平及逍遥散剂量依赖性地下调该信号通路发挥治疗效果,米氮平与高剂量治疗效果相似,且逍遥散的高剂量为逍遥散各剂量中的最优剂量。(3)肝郁脾虚证胃肠运动障碍可能与胃泌素、抑胃肽含量变化有关系,且逍遥散可能通过促进胃泌素,抑制抑胃肽分泌而发挥治疗作用。本研究首次证实了肝郁脾虚证大鼠肠道NPs-NPRs-pGC-cGMP信号通路上调的事实,并阐明了疏肝健脾法典型方剂逍遥散对肝郁脾虚证胃肠运动障碍的干预机制。这项研究成果对研究肝郁脾虚证胃肠运动障碍的发病机制有重要的理论意义,并提供了一定的实验依据。
【关键词】：钠尿肽 钠尿肽受体 肝郁脾虚证 胃肠运动 逍遥散
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R285.5
【目录】：

• 中文摘要7-12
• 英文摘要12-18
• 前言18-21
• 第一部分 肝郁脾虚证大鼠模型制备 及逍遥散、米氮平的干预作用21-28
• 材料和方法21-24
• 结果24-28
• 第二部分 肝郁脾虚证大鼠肠道 NPs 的表达变化 及逍遥散、米氮平的干预作用28-42
• 材料和方法28-32
• 结果32-42
• 第三部分 肝郁脾虚证大鼠肠道内NPRs的表达变化 及逍遥散、米氮平的干预作用42-60
• 材料和方法42-44
• 结果44-60
• 第四部分 肝郁脾虚证大鼠胃肠激素 及 c GMP 含量变化60-67
• 材料和方法60-61
• 结果61-67
• 讨论67-73
• 结论73-74
• 参考文献74-79
• 综述一79-99
• 参考文献92-99
• 综述二99-116
• 参考文献113-116
• 附录116-119
• 攻读学位期间发表论文情况119-120
• 致谢120-121

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本文编号：645547