中国被毛孢菌丝体多糖提

发布时间：2017-08-11 11:03

  本文关键词：中国被毛孢菌丝体多糖提取、结构表征及抗肿瘤活性研究

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【摘要】：冬虫夏草是我国名贵的药用真菌,具有多种药效,多糖是其最主要的药理活性成分之一。虫草多糖具有抗肿瘤、免疫调节、降血糖等多种生物活性,其生物活性与多糖的结构紧密相关,且多糖的结构十分复杂,所以研究和分析虫草多糖结构能够为其生物活性研究奠定基础。本课题以本实验室保存的冬虫夏草菌为研究对象,研究的主要内容及结果如下：通过固体培养对菌种进行验证。将活化好的菌种转接于PDA培养基上,在16℃、18℃、20℃、22℃的不同温度条件下恒温培养30天,以菌落直径为判断依据,确定该菌种生长的最适温度为18℃。然后在18℃下进行固体培养菌种观察其菌落、菌丝体和分生孢子的形态和大小,通过参考文献确定该菌种是冬虫夏草的无性型中国被毛孢。利用苯酚-硫酸法测定菌丝体中多糖含量为4.71%±0.09%；利用HPLC分别测定虫草菌丝体中的腺苷和虫草素含量为3.47%±0.31 mg/g和1.32±0.19 mg/g；利用紫外分光光度计法测定虫草酸含量为8.50%±0.05%；利用凯氏定氮法测定蛋白含量为31.97%±0.08%；利用索氏抽提法测定脂肪含量为8.09％±0.89%。实验结果表明人工培养得到的菌丝体与天然冬虫夏草具有相似的有效成分,并且其含量与天然冬虫夏草含量相近。对液体培养得到虫草菌丝体,通过水提醇沉法,分离纯化得到分子质量均一的大分子多糖HSP-Ⅲ,其糖含量和分子质量分别为89.87%和513.89 KDa。通过紫外光谱扫描检测,表明HSP-Ⅲ中无蛋白、多肽及核酸的存在。采用比旋光仪、红外光谱、核磁共振、薄层层析、高碘酸氧化和Smith降解、气相色谱、圆二色谱、电子显微镜等技术手段,分析大分子多糖HSP-Ⅲ为α-(1→3)糖苷键链接的呋喃葡聚糖主链的葡聚糖；单糖主要由甘露糖和半乳糖组成；HSP-Ⅲ能与刚果红发生络合,是具有(+) cotton效应的三股螺旋结构。HSP-Ⅲ的形貌为通过链状和颗粒状结构交联而成片状聚集体。通过MTT法测得中国被毛孢菌丝体多糖的抗肿瘤活性,在100μg/mL和400μg/mL时效果最好,抑制率分别为79.04%和78.17%,HSP-Ⅲ的抗肿瘤效果高于HSP-Ⅱ。
【关键词】：中国被毛孢 菌丝体多糖 纯化 结构 抗肿瘤活性
【学位授予单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R284;R285
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-10
• 1 前言10-20
• 1.1 冬虫夏草概述10-11
• 1.1.1 虫草属真菌的种类资源10
• 1.1.2 冬虫夏草生态学研究10-11
• 1.2 冬虫夏草无性型研究概况11-13
• 1.2.1 无性型的培养11-12
• 1.2.2 无性型培养特征12
• 1.2.3 无性型鉴定方法12-13
• 1.3 冬虫夏草有效成分的研究13-14
• 1.3.1 核苷类13
• 1.3.2 虫草酸13
• 1.3.3 蛋白质和氨基酸13-14
• 1.3.4 糖醇和甾醇14
• 1.3.5 脂肪和脂肪酸14
• 1.3.6 其他类成分14
• 1.4 虫草多糖研究进展14-17
• 1.4.1 虫草多糖分离纯化研究15
• 1.4.2 虫草多糖结构研究15-17
• 1.5 虫草多糖抗肿瘤的研究现状17-18
• 1.6 研究的目的、意义及主要内容18-20
• 1.6.1 研究的目的和意义18
• 1.6.2 研究的主要内容18-20
• 2 材料与方法20-35
• 2.1 实验材料、试剂与仪器20-23
• 2.1.1 实验材料20
• 2.1.2 实验仪器20-21
• 2.1.3 实验试剂21-23
• 2.1.4 实验主要溶液和培养基23
• 2.2 试验方法23-35
• 2.2.1 菌种活化实验23
• 2.2.2 菌种固体培养23-24
• 2.2.3 菌丝显微结构观察24
• 2.2.4 菌种液体培养24-25
• 2.2.5 中国被毛孢有效成分分析25-27
• 2.2.6 菌丝体多糖提取27
• 2.2.7 菌丝体多糖纯化27-28
• 2.2.8 多糖含量测定28-29
• 2.2.9 多糖纯度鉴定29
• 2.2.10 多糖分子质量分布的测定29
• 2.2.11 多糖比旋光的测定29-30
• 2.2.12 红外光谱分析30
• 2.2.13 核磁共振分析30
• 2.2.14 单糖组成分析30-31
• 2.2.15 高碘酸氧化和Simth降解31-33
• 2.2.16 刚果红试验33
• 2.2.17 圆二色谱分析33
• 2.2.18 扫描电镜观察33-34
• 2.2.19 抗肿瘤活性研究34-35
• 3 结果与讨论35-60
• 3.1 冬虫夏草菌固体培养35-38
• 3.1.1 菌种最适生长温度的确定35-36
• 3.1.2 菌落特征观察36
• 3.1.3 光学显微镜观察36-37
• 3.1.4 扫描电镜观察37-38
• 3.1.5 虫草菌固体培养总结38
• 3.2 中国被毛孢的液体培养38-41
• 3.2.1 种子液的生长曲线38-39
• 3.2.2 发酵液的生长曲线39-40
• 3.2.3 最适培养温度的确定40-41
• 3.2.4 液体培养的总结41
• 3.3 中国被毛孢有效成分分析41-43
• 3.3.1 多糖含量分析41
• 3.3.2 腺苷和虫草素含量分析41-42
• 3.3.3 虫草酸含量分析42-43
• 3.3.4 蛋白质含量分析43
• 3.3.5 脂肪含量分析43
• 3.3.6 有效成分分析总结43
• 3.4 中国被毛孢菌丝体多糖提取43-44
• 3.4.1 虫草多糖提取43
• 3.4.2 虫草多糖纯化43-44
• 3.5 多糖含量的测定44-45
• 3.5.1 总糖含量的测定44
• 3.5.2 还原糖含量的测定44-45
• 3.5.3 多糖含量的计算45
• 3.6 多糖纯度的鉴定45-46
• 3.7 多糖分子质量的测定46-47
• 3.8 比旋光度分析47
• 3.9 多糖的红外分析47-48
• 3.10 多糖的核磁分析48-50
• 3.10.1 ~1HNMR分析48-49
• 3.10.2 ~(13)CNMR分析49-50
• 3.11 多糖的单糖组成分析50-52
• 3.11.1 单糖薄层层析50-51
• 3.11.2 气相分析51-52
• 3.12 多糖的连接方式分析52-55
• 3.12.1 高碘酸氧化分析52-53
• 3.12.2 Smith降解分析53-55
• 3.13 刚果红试验55-56
• 3.14 圆二色谱分析56-57
• 3.15 多糖扫描电镜分析57
• 3.16 多糖抗肿瘤活性分析57-60
• 4 结论60-61
• 5 展望61-62
• 6 参考文献62-69
• 7 硕士期间发表论文等情况69-70
• 8 致谢70

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本文编号：655729