基于动力学ELISA法检测血清天然抗体及其与HLA-DQB1携带差异分析的关联

发布时间：2017-08-18 14:15

  本文关键词：基于动力学ELISA法检测血清天然抗体及其与HLA-DQB1携带差异分析的关联

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【摘要】：目的:本文基于常规酶联免疫吸附测定方法,建立了动力学酶联免疫吸附测定法,在无需改变原有仪器设备的基础上提高了试验的准确度和精密度,达到试验性能的提高;同时还使用此法对自身免疫病及其他疾病患者血清天然抗体进行检测,并在分子水平上研究HLA-DQB1基因携带差异与人体天然抗体的关联。方法:1.随机选择一份血清,使用常规酶联免疫吸附测定方法,针对其试验中的各个环节可能存在的影响因素进行多因素多水平定量分析,探究其对结果的影响,找出对实验结果影响较大的因素。2.建立动力学酶联免疫吸附测定的检测波长和方法,并对其线性、精密度和准确度进行考察,同时使用动力学酶联免疫吸附测定法对常规酶联免疫吸附测定法中存在的对试验结果影响较大的因素进行测定。3.随机选择50例患者血清,使用动力学酶联免疫吸附测定法对其四种天然抗体(抗卵清蛋白抗体、抗淀粉多糖抗体、抗卵核抗体、抗牛血清蛋白抗体)分布情况进行检测。同时采集其他疾病患者全血标本,采用PCR-SSP技术检测50例患者全血中的HLA-DQB1等位基因,分析HLA-DQB1等位基因携带差异与天然抗体分布的关联。4.随机选择176例自身免疫病患者血清,使用动力学酶联免疫吸附测定法对其四种天然抗体进行检测,分析各种自身免疫病人群天然抗体之间是否存在差异。结果:1.通过探索的酶联免疫吸附试验中的血清浓度、孵育温度、洗板次数、酶作用时间、加入终止液后测量时间、不同微孔板等6个影响因素,得出酶作用时间、血清浓度、微孔板、底物反应时间为影响最大的四种影响因素,其他三种因素孵育温度,洗板次数、加入终止液后测量时间虽然对测量结果也有部分影响,但是可在试验过程中通过严格控制反应条件得到有效控制。同时使用试剂盒验证结果,得出四种较大影响因素对试验结果的影响大小依次为:酶作用时间血清浓度微孔板底物反应时间,底物反应时间的影响大幅减少,几乎可以忽略(P0.005)。2.新建立的动力学酶联免疫吸附测定方法,其血清稀释试验具有良好的线性,在重复试验中,批内重复实验CV值为8.91%,批间重复实验CV值为8.02%,表明该方法具有良好的稳定性;在灵敏度考察试验中,常规方法检测的表面抗体阳性血清稀释倍度为10 mIU/ml,动力学方法为0.625 mIU/ml,表明本法具有良好的灵敏度和准确度;用本法测定影响因素,底物作用时间、微孔板对结果的影响基本得到消除,酶作用时间的影响也在较大程度上得到消除。3.在HLA-DQ B1基因多态性与天然抗体相关性分析中,发现人血清抗牛血清蛋白抗体的高低与HLA-DQB1*04位点呈现显著性相关。4.各组自身免疫病患者血清内天然抗体含量有显著差异。结论:1.动力学酶联免疫吸附测定方法具有良好的检测精密度和准确度,具有应用价值。2.HLA-DQB1*04基因可能与抗牛血清蛋白抗体的含量高低存在一定的关联。3.自身免疫病人群天然抗体含量有差异。
【关键词】：酶联免疫吸附测定 动力学 天然抗体 HLA 自身免疫病
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R446.6
【目录】：

• 中文摘要10-12
• 英文摘要12-14
• 前言14-18
• 参考文献16-18
• 第一章 酶联免疫吸附测定影响因素的定量分析18-28
• 材料和方法19-22
• 1.1 酶联免疫吸附测定影响因素三水平定量分析19-21
• 1.1.1 标本来源19
• 1.1.2 抗原包被19
• 1.1.3 试验方法19
• 1.1.4 加样操作19
• 1.1.5 常规ELISA试验操作过程19-20
• 1.1.6 试验影响因素定量分析20-21
• 1.2 酶联免疫吸附试验影响因素多因素五水平定量分析21
• 1.2.1 酶作用时间对ELISA方法的影响21
• 1.2.2 多因素五水平定量分析21
• 1.3 人乙型肝炎病毒表面抗体诊断试剂盒验证ELISA影响因素21-22
• 1.4 统计分析22
• 结果22-25
• 1.1 试验影响因素定量分析22-24
• 1.2 酶联免疫吸附试验影响因素定量分析24
• 1.2.1 酶作用时间对ELISA方法的影响24
• 1.2.2. 多因素五水平定量分析24
• 1.3. 人乙型肝炎病毒表面抗体诊断试剂盒验证ELISA影响因素24-25
• 讨论25-26
• 结论26-27
• 参考文献27-28
• 第二章 基于常规ELISA通过检测酶动力学参数提高实验性能方法的建立28-46
• 材料和方法29-33
• 1.1 检测波长的确立29
• 1.2 检测血清中抗卵清抗体的动力学酶联免疫吸附测定方法(K-ELISA)的建立29-30
• 1.3 线性研究30
• 1.4 稳定性考察30-32
• 1.4.1 批内重复试验30
• 1.4.2 批间重复试验30-31
• 1.4.3 试验校正曲线的建立31-32
• 1.5 适应性及灵敏度检验32
• 1.6 动力学酶联免疫吸附测定ELISA法中影响因素32-33
• 1.7 统计分析33
• 结果33-42
• 1.1 检测波长的确立33-34
• 1.2 线性研究34-36
• 1.3 稳定性考察36-39
• 1.3.1 批内重复性试验36-37
• 1.3.2 批间重复试验37-39
• 1.4 适用性和灵敏度检验39-40
• 1.5 动力学酶联免疫吸附试验测定ELIS A法中影响因素40-42
• 讨论42-44
• 结论44-45
• 参考文献45-46
• 第三章 人体内天然自身抗体分布与HLA-DQB1基因携带的差异分析46-60
• 材料和方法47-53
• 1.1 人全血基因组DNA提取47
• 1.1.1 标本来源47
• 1.1.2 全血DNA提取47
• 1.2. PCR扩增HLA-DQB147-51
• 1.2.1 PCR扩增采用的引物47-49
• 1.2.2 目的基因扩增49-51
• 1.2.3 PCR产物鉴定51
• 1.3 四种天然抗体的测定51-52
• 1.3.1 抗原包被微孔板的制备51-52
• 1.3.2 天然抗体的测定52
• 1.3.2.1 标本来源52
• 1.3.2.2 动力学酶联免疫吸附试验测定天然抗体52
• 1.4 统计分析52-53
• 结果53-57
• 1.1 稀释试验结果PCR扩增HLA-DQB1结果53
• 1.2 HLA- DQB1等位基因在50份标本中的分布频率结果53-54
• 1.3 HLA- DQB1等位基因与人体天然抗体分布相关性分析54-57
• 讨论57-58
• 结论58-59
• 参考文献59-60
• 第四章 动力学酶联免疫吸附测定检测天然抗体与疾病的关系60-69
• 材料和方法61-62
• 1.1 天然抗体与自身免疫的病的相关性61
• 1.1.1 抗原包被板的制备61
• 1.1.2 天然抗体与自身免疫病的关联61
• 1.2 统计分析61-62
• 结果62-66
• 1.1 自身免疫病人群中天然抗体的分布差异62
• 1.2 抗淀粉多糖抗体在自身免疫病人群中的分布比较62-64
• 1.3 抗牛血清蛋白抗体在自身免疫病人群中的分布比较64-66
• 讨论66-67
• 结论67-68
• 参考文献68-69
• 全文总结69-70
• 工作展望70-71
• 综述71-82
• 参考文献79-82
• 附录82-84
• 个人简历84-85
• 致谢85-86

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8 谢正e，

本文编号：695016