辣木多糖的提取与体外抗丙肝病毒活性的研究

发布时间：2017-08-23 06:38

  本文关键词：辣木多糖的提取与体外抗丙肝病毒活性的研究

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【摘要】：辣木(Moringa Oleifera),又名鼓槌树,属于木本植物,不仅可以直接食用,且经过加工处理后还可以制成保健品、化妆品等,还被许多实验人员作为试验材料进行研究。辣木的营养成分丰富,主要有钙、铁、多糖、黄酮等,其中多糖属于辣木的主要活性成分之一。研究发现多糖主要分为动物多糖、植物多糖和微生物多糖三种,具有抗病毒、抗肿瘤等生物活性,并且具备毒性低、来源广、易制备等优点,可以作为一种理想的天然药物和功能性食品进行开发利用。丙型肝炎病毒(HCV)属于黄病毒科,全球感染人数逐年上升,严重威胁人类的健康。目前,HCV治疗方案的疗效低、副作用大,且针对HCV的疫苗依旧处于空白阶段。尽管国内外关于多糖活性的研究报道很多,如山药多糖抗细小病毒、扇贝多糖抗乙肝病毒等,但是针对辣木及其多糖的研究却鲜有报道,目前仅仅是局限在辣木成分的提取和分离上,尚未开展关于辣木多糖抗病毒活性等方面的研究,更没有其抗丙肝病毒的研究。本文以辣木为原料,系统地研究了辣木多糖的提取、分离和纯化,并用WST-1法和荧光定量PCR法对其抗丙肝病毒的生物活性和作用方式进行了初步探讨。1、辣木多糖的提取、纯化。本试验采用热水提取法,提取工艺：提取料液比1：10,浸提温度80℃,提取时间为90min,提取次数3次,并用DEAE Sepharose Fast Flow快速流纤维柱对溶解于浓度为0.1mol/L～lmol/L NaCl的辣木多糖进行分离纯化,分别考察了Sevage法、三氯乙酸法和酶解法三种除蛋白质方法的纯化效果,优化了提取工艺,并用苯酚-硫酸法测定多糖的含量。研究证明：Sevage法去除蛋白质所得到的辣木多糖,外观上深黄色、块状、不易溶于热水中,多糖含量为29.5%；三氯乙酸法去除蛋白质所得到的多糖,外观上黄白色、粉末状、较易溶于热水中,多糖含量为31.6%；酶解法所得多糖,外观上浅黄色、棉花样、极易溶于冷水中,多糖含量为39.5%。以上三种方法所得到的多糖均易返潮,需注意干燥保存。Sevage法去除蛋白质试剂浪费严重,并且多糖会随着蛋白质一起流失,导致多糖大量损失；三氯乙酸法去除蛋白质多糖容易发生降解；酶解法辅助热水提取多糖,多糖不容易发生降解,并且可以保持较高的活性,还能够显著提高多糖的含量,是一种较为理想的多糖提取方法。2、辣木多糖的抗病毒活性研究。本试验采用体外细胞培养法对辣木多糖抗丙肝病毒的活性进行研究。用水溶性四唑盐法(WST-1法)测定多糖对人肝癌细胞(Huh7.5.1)的细胞毒性作用,利用荧光定量PCR法,探讨辣木多糖的抗病毒活性,并且采用三种不同的接种方式,即先加多糖后加病毒、先加病毒后加多糖、病毒多糖同时作用,初步研究辣木多糖抗病毒的作用方式。结果表明,在WST-1试验中得出浓度在7.8μg/mL～125μg/mL范围内,辣木多糖对Huh7.5.1细胞无毒性作用,即安全浓度范围。运用荧光PCR法测定得到辣木多糖对HCV有一定的抗病毒活性,同时采用先加多糖后加病毒的作用方式优于其他两种方式,并且多糖的最适浓度为62.5μg/mL,存在一定的浓度依赖性,即加入的多糖浓度越大,抗HCV活性越好,提示在临床应用时辣木多糖可以用于预防。
【关键词】：辣木多糖 提取纯化 细胞毒性 抗病毒作用
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R284.2;R285
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 缩写说明8-11
• 前言11
• 1 文献综述11-19
• 1.1 辣木的概况11-12
• 1.1.1 辣木的分布情况11
• 1.1.2 辣木的营养价值11
• 1.1.3 辣木的药用价值11-12
• 1.2 植物多糖的研究现状12-16
• 1.2.1 多糖的分离12-13
• 1.2.2 多糖的纯化13-15
• 1.2.3 多糖的活性研究15-16
• 1.3 丙肝病毒的初步概况16-17
• 1.4 本课题的研究意义和研究内容17-19
• 1.4.1 研究意义17-18
• 1.4.2 主要的研究内容18-19
• 2 试验材料与方法19-25
• 2.1 试验材料19
• 2.1.1 主要试剂19
• 2.1.2 仪器设备19
• 2.2 试验方法19-25
• 2.2.1 辣木的处理19-20
• 2.2.2 辣木多糖的提取20
• 2.2.3 总糖含量的测定20-21
• 2.2.4 辣木多糖的纯化21-22
• 2.2.5 辣木多糖抑制丙肝病毒感染试验22-25
• 2.2.6 统计学处理25
• 3 结果与分析25-31
• 3.1 总糖标准曲线的建立25-26
• 3.2 辣木多糖不同除蛋白方法的比较研究26
• 3.3 离子交换柱分离纯化辣木多糖26-27
• 3.4 辣木多糖细胞毒性试验27-28
• 3.5 辣木多糖抗病毒试验28-31
• 3.5.1 建立标准曲线28
• 3.5.2 荧光PCR检测结果28-31
• 4 讨论31-33
• 4.1 多糖的制备31-32
• 4.2 辣木多糖抗病毒活性的研究32-33
• 4.2.1 辣木多糖对Huh7.5.1细胞毒性作用32
• 4.2.2 先加多糖后接病毒32
• 4.2.3 先接病毒后加多糖32-33
• 4.2.4 同时加入病毒和多糖33
• 5 结论33-35
• 参考文献35-40
• 致谢40

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本文编号：723557