白藜芦醇对人胶质瘤及髓母细胞瘤细胞蛋白质组调节作用的初探

发布时间：2017-08-23 06:01

  本文关键词：白藜芦醇对人胶质瘤及髓母细胞瘤细胞蛋白质组调节作用的初探

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【摘要】：背景及目的:人脑胶质瘤及髓母细胞瘤是临床上常见的神经系统恶性肿瘤,均具有较高的侵袭性及扩散性,目前临床上尚无有效治疗手段,即使采用手术结合放化疗也会给患者预后造成很大影响。有研究表明,药物治疗是提高患者生存质量的重要手段。白藜芦醇是具有多种生物学功效的天然多酚类化合物,其抗肿瘤作用日趋受到重视,本课题旨在研究白藜芦醇对脑肿瘤细胞系蛋白质组的影响,探讨白藜芦醇可能的作用机制及细胞系敏感性差异原因,寻找可能存在的抗肿瘤作用靶点或肿瘤耐药机制,为深入开展本领域研究、实现药物临床转化及肿瘤个体化治疗提供依据。实验内容主要包括(1)蛋白质水平的影响:观察对白藜芦醇存在敏感性差异的不同脑肿瘤细胞系,在白藜芦醇药物处理前后,蛋白质组的改变。(2)筛选及鉴定:选取若干药物处理前后存在差异表达的蛋白,运用质谱技术对其蛋白属性加以鉴定。(3)差异蛋白质验证:采用免疫组化和RT-PCR等方法,对鉴定出的蛋白在白藜芦醇处理前后细胞中的表达进行核实。(4)数据整理分析:绘制可能存在的调控肿瘤生长的生物网络。方法:(1)筛选与药物处理:选取两种脑肿瘤细胞系(胶质瘤及髓母细胞瘤),每种细胞系再分别选取对白藜芦醇敏感性存在差异的细胞系(胶质瘤敏感型:U251、欠敏感型:LN18及髓母细胞瘤敏感型:UW228-3、欠敏感型:DAOY)。细胞系u251、ln18及uw228-3培养于低糖dmem培养基(low-dulbecco’smodifiedeaglemedium,l-dmem)中,daoy培养于rpmi1640培养基(roswellparkmemorialinstitute1640,rpmi1640)中,各培养基中分别含有10%胎牛血清和1%抗生素(青霉素和链霉素),药物处理组用100μm的白藜芦醇(resveratrol,简写res)处理48h,收取细胞片用he染色观察细胞形态。(2)蛋白双向电泳分离及质谱鉴定:收取细胞提取全蛋白进行双向凝胶电泳(two-dimensionalgelelectrophoresis,2-de),蛋白质酶切技术对变化差异点进行蛋白质酶切,质谱技术(massspectrometry,ms)对酶切样品进行质谱鉴定。(3)蛋白鉴定结果验证:采用免疫细胞化学及免疫印迹技术对发现的新的蛋白结果进行验证,采用rt-pcr技术对调节新蛋白表达的基因进行基因水平的验证。结果:(1)形态学改变:细胞系u251及uw228-3白藜芦醇处理前后形态及数量上都有明显的变化,均出现了神经元样变化且细胞数量减少,而细胞系ln18及daoy经过白藜芦醇处理前后,其形态和数量上几乎没有改变,提示:u251、uw228-3细胞系和ln18、daoy细胞系对白藜芦醇存在明显敏感性差异。(2)蛋白质组学实验:1)蛋白质组整体影响:主要以上调为主,胶质瘤细胞系中,u251实验组,正常组n检出310个蛋白点,对照组res共检出271个蛋白点,其中电脑软件匹配结果共170个,上调比64.7%;在ln18细胞系中,正常组n检出422个蛋白点,对照组res共检出405个蛋白点,电脑软件匹配共269个,上调比64.3%。髓母细胞瘤细胞系中,daoy组中,正常组n共检出298个点,对照组res共检出342个点,软件匹配234个,上调比42.7%;uw228-3组中,正常组n共检出177个点,对照组res共检出118个点,软件配对69个,上调比49.3%。2)差异蛋白质鉴定:蛋白质谱鉴定结果为烯醇化酶,磷酸甘油酸变位酶,角蛋白,膜联蛋白,膜突蛋白,热休克蛋白等。(3)差异蛋白质的验证:随机选取几个蛋白进行rt-pcr验证,eno1、pdia1、akr1b1等均表现为用药后表达水平下降,而两种角蛋白在两种敏感性细胞系中几乎未检测到表达,在不敏感细胞系用药后略有升高,cap1在daoy和u251中出现了上调,cap1在uw228-3中下调明显,在ln18中变化不明显。(4)选取的表达共性的蛋白烯醇化酶eno1的wb实验结果与免疫细胞化学(icc)实验结果一致,均出现了药物处理后下调,与双向电泳结果符合。结论:(1)初步得到了四种脑肿瘤细胞系白藜芦醇处理前后蛋白质表达谱,为更深入的研究提供参考。(2)无论是敏感或不敏感的四种细胞系,在白藜芦醇药物处理后,各自的蛋白质组均有不同程度的改变。(3)药物处理后,表达差异明显的蛋白主要集中在能量代谢、细胞骨架结构、肿瘤迁移和炎症应激反应等方面,提示白藜芦醇可能具有多种生物学功能。(4)表达发生变化的这些蛋白质存在直接或间接地联系,构成一种生物网络,为下一步实验研究指明了方向。
【关键词】：白藜芦醇 胶质瘤 髓母细胞瘤 差异蛋白质组学 双向电泳 质谱
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R285
【目录】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-14
• 材料与方法14-29
• 实验结果29-47
• 讨论47-51
• 实验结论及进一步研究设想51-52
• 参考文献52-56
• 综述56-69
• 参考文献64-69
• 攻读学位期间发表论文情况69-70
• 致谢70-71

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本文编号：723353