高血压心肌重构中泛素活化酶的抑制对心肌肥厚的影响和治疗研究

发布时间：2017-09-06 23:11

  本文关键词：高血压心肌重构中泛素活化酶的抑制对心肌肥厚的影响和治疗研究

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【摘要】：背景和目的:高血压所致的心肌重构以心脏负荷增加导致的心肌肥厚为主要表现之一。继发性心肌肥厚也主要发生在高血压性心肌病,肺动脉高压和慢性充血性心力衰竭中,而心肌肥厚又明显增加心律失常、心衰、及猝死率。心肌肥厚的发生发展机制十分复杂,目前的药物对抗心肌肥厚的作用欠佳,探索抑制心肌肥厚甚至逆转心肌肥厚的新机制和治疗药物,是全世界医疗工作者面临的重要课题和研究方向。泛素蛋白酶体系统(UPS)广泛存在于心肌组织中负责参与细胞内80%以上蛋白质的降解从而影响心肌重构的过程,已有研究表明部分抑制泛素蛋白酶体活性可以抑制体外心肌细胞的肥厚,因此我们假设抑制处于UPS系统起始位点的关键泛素活化酶(UBA1、E1)可能具有更强大的抑制心肌肥厚的作用,本课题的研究目的是明确高血压所致心肌重构过程中泛素活化酶E1的变化,以及明确抑制E1活性能否抑制体内、体外试验中血管紧张素II诱导的心肌肥厚,为临床治疗心肌肥厚提供新的研究靶点和治疗药物。方法:临床资料:临床心脏瓣膜病患者,开胸接受瓣膜置换手术切取的心耳组织,石蜡切片行免疫组化染色检测泛素活化酶E1在人体心脏组织的表达情况。体内实验:选取C57BL/6品系周龄6-8周雄性小鼠,将其随机分入6组:对照组、血管紧张素II(AngII)埋泵组、E1抑制剂对照组(PYR-41 5mg/kg)、E1抑制剂对照组(PYR-41 10mg/kg)、血管紧张素II埋泵+E1抑制剂治疗组(PYR-41 5mg/kg)、血管紧张素II埋泵+E1抑制剂治疗组(PYR-41 10mg/kg)。AngII(体内灌注1000ng/kg/min)埋泵建立高血压心肌肥厚以及抑制剂注射治疗心肌肥厚2周后,采用动物心脏超声检测小鼠心肌肥厚及心功能情况、荧光麦胚凝集素(wga)染色观察小鼠心脏组织心肌细胞肥厚及治疗情况。体外实验:选取sd大鼠出生24小时以内的雄性乳鼠,提取乳鼠心肌原代细胞(nrcs)培养,将细胞随机分组培养于细胞培养皿分8组:对照组、angii组(100nm)、e1抑制剂对照组(5um)、e1抑制剂对照组(10um),angii+e1抑制剂治疗组(5um),angii+e1抑制剂治疗组(10um),苯肾上腺素(phenylephrine,pe)组、pe+e1抑制剂治疗组(5um),pe+e1抑制剂治疗组(10um)。药物刺激24小时后,对各组心肌进行免疫荧光染色测定细胞肥大情况、提取细胞总蛋白行聚丙烯酰胺凝胶电泳(westernblot)观察泛素活化酶(e1)表达水平的改变。提取组织总蛋白行westernblot观察细胞外信号调节激酶erk表达水平的改变。所有数据均以平均值±标准误差表示,统计学差异性p0.05认为差异有统计学意义,采用graphpadprism和spss软件利用kruskalwallis、onewayanova方法检测各组数据差异性。结果:1.人体心脏组织中泛素活化酶e1广泛存在,e1也广泛存在于鼠心肌细胞中。2.angii诱导的小鼠高血压心肌肥厚3天、7天、14天后,与对照组相比,小鼠心脏组织中泛素活化酶e1表达显著增高,p0.05。体外angii分别以25nm、50nm、100nm浓度刺激乳鼠心肌细胞,与对照组相比,50nm、100nm浓度刺激组e1表达显著增高(p0.05)。3.angii刺激血压升高引起心肌肥厚,与对照组相比,小鼠心重体重比增大、心脏前后壁厚度增厚,左室射血分数与短轴缩短率下降(p0.05)。angii+e1抑制剂治疗组小鼠心重比未见明显增大、心脏前后壁未见明显肥厚,左室射血分数与短轴缩短率与对照组相比未见明显差异(p0.05)。4.angii泵植入小鼠体内1周后,与对照组相比,angii组动脉收缩压显著升高(p0.05),angii+e1抑制剂治疗组血压显著升高(p0.05),对照组与单纯抑制剂对照组相比血压无差异(p0.05)。5.angii与pe刺激体外心肌细胞肥大,使细胞体积肥大近对照组2倍。与肥大组相比,e1抑制剂在5um和10um浓度下均能显著抑制心肌细胞肥大(p0.05)。6.angii可引起小鼠体内胞外信号调节激酶erk磷酸化表达升高,e1抑制剂可显著抑制磷酸化erk的表达从而抑制心肌肥厚相关的信号通路。结论:1.血管紧张素II诱导的高血压心肌肥厚过程中,泛素活化酶E1的表达显著进行性增高。血管紧张素II的刺激剂量与E1的表达增高呈正相关。2.E1特异性抑制剂PYR-41可以抑制高血压导致的心肌肥厚,同时具有保护心脏功能的作用。E1抑制剂可以抑制体外血管紧张素II、苯肾上腺素引起的心肌细胞肥大。3.血管紧张素II引起的高血压不能被E1抑制剂降压,E1抑制剂治疗心肌肥厚不是通过降低血压的作用机制实现的。4.E1抑制剂通过抑制胞外信号调节激酶ERK磷酸化(p-ERK)是其抑制心肌肥厚的机制之一。
【关键词】：高血压 心肌肥厚 血管紧张素 II 泛素活化酶 E1 胞外信号调节激酶
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R544.1;R542.2
【目录】：

• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-14
• 前言14-16
• 材料16-18
• 一、实验对象16
• 二、实验材料16-18
• 1、主要抗体16
• 2、主要试剂16-17
• 3、实验设备17-18
• 方法18-25
• 1. 临床人体心脏组织样本的获取与保存18
• 2. AngII诱发的体内高血压心肌肥厚实验18-19
• 3. 原代心肌细胞培养19
• 4. 体外心肌细胞肥大模型及抑制试验19-20
• 5. 动脉血压测定：无创伤尾套法20
• 6. 药物注射20
• 7. 超声心动图检测20
• 8. 心脏组织取材及病理切片20-21
• 9. 免疫组化染色21
• 10. WGA染色21-22
• 11. 细胞免疫荧光染色22
• 12. 蛋白质提取22-23
• 13. Western Blot23-25
• 结果25-32
• 1. 人体心肌组织和大鼠心肌细胞中泛素活化酶广泛存在25-26
• 2. AngII诱导的高血压心肌肥厚过程中泛素活化酶显著增高26-27
• 3. AngII诱导高血压所致心肌肥大可被泛素活化酶抑制剂抑制27-31
• 3.1 AngII显著升高血压，泛素活化酶抑制剂不具有降压作用27
• 3.2 体内AngII诱导的高血压心肌肥厚可被泛素活化酶抑制剂抑制27-30
• 3.3 体外AngII、PE诱导的心肌细胞肥大可被泛素活化酶抑制剂抑制30-31
• 4. 泛素活化酶抑制剂参与抑制ERK信号通路31-32
• 讨论32-36
• 结论36-37
• 参考文献37-42
• 综述42-54
• 参考文献49-54
• 攻读学位期间发表文章54-55
• 致谢55-56

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本文编号：805984