中草药独角莲根茎提取物β-谷甾醇（β-sitosterol）对瘢痕疙瘩成纤维细胞作用的实验研究
本文关键词：中草药独角莲根茎提取物β-谷甾醇（β-sitosterol）对瘢痕疙瘩成纤维细胞作用的实验研究
【摘要】：研究背景:近期研究认为,独角莲根茎水提取物(the aqueous extract from deied powdered rhizomes of Typhonium giganteum Engl.AEoTGE)对瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖具有抑制作用,其作用于细胞24h后,可显着促进细胞凋亡,凋亡率高达72%。然而,中草药独角莲根茎成分复杂,其水提取物亦为混合物,并未能阐明其确切作用机制。独角莲茎块中含有β-谷甾醇和β-谷甾醇-D-葡萄糖苷。并且,研究表明β-谷甾醇(β-sitosterol)对乳腺癌细胞、结肠癌细胞、口腔癌及食管癌等癌细胞的增殖活性均有抑制作用,通过内源性和外源性途径共同诱导癌细胞凋亡。因此,β-谷甾醇(β-sitosterol)可能影响瘢痕疙瘩成纤维细胞生物学特性。我们采用体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞方法,并以β-谷甾醇(β-sitosterol)作为研究药物,以不同浓度作用于细胞,了解药物作用下细胞的增殖过程,并检测β-谷甾醇(β-sitosterol)是否促进细胞凋亡,作为独角莲治疗瘢痕的深入研究。目的:研究中草药独角莲根茎提取物β-谷甾醇(β-sitosterol)对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和凋亡的影响。方法:1、取患者耳部瘢痕疙瘩作为标本,瘢痕疙瘩均由于皮肤穿刺受损后引起,发病3月余。患病后患者未经过任何手术、药物注射及物理治疗。所取组织于4摄氏度环境中运送至实验室,原代瘢痕疙瘩成纤维细胞均由体外组织块培养法提取。2、选用生长状态良好第三代细胞,消化离心后,细胞计数板计数。收集细胞数量一百万个细胞,乙醇脱水后,在透射电镜下观察细胞胞核、细胞质、高尔基体以及内质网等超微结构,并对细胞予以鉴定。3、选取对数生长期细胞,以含有浓度为20umol/L、30umol/L、40umol/L、50umol/Lβ-谷甾醇的培养液孵育培养细胞24h,采用Cell Counting Kit8细胞增殖检测法测定24h内β-谷甾醇对细胞活性的影响,于4h后用酶标仪在450nm波长下测定吸光度值。实验进行三次,得出有效浓度梯度。4、选用生长状态良好第三代细胞,消化离心后,细胞计数板计数。对照组加入含有溶剂的全培养液,实验组分别加入不同浓度β-谷甾醇,终浓度为(30umol/L 40umol/L 50umol/L),孵育箱孵育24h后,离心、重悬,加入500ul Binding Buffer液轻轻重悬细胞,随后加入5ul FITC-Annexin V和10ul PI染色液,检测相应浓度下细胞凋亡率。结果:1、β-谷甾醇作用24h后,30uM 40uM 50uM药物浓度下,瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长明显受到抑制。浓度为20uM时,细胞活性未受到明显影响,当药物浓度大于30uM时,β-谷甾醇对细胞的抑制作用逐渐增强,与溶剂组和对照组相比,抑制作用明显(p0.05);2、FITC-Annexin V/PI细胞流式染色显示药物组(30umol/L40umol/L 50umol/L)凋亡率分别为8.5㳠,18.0㳠,33.2㳠,对照组为3㳠(p0.05)。结论:β-谷甾醇作用于瘢痕疙瘩成纤维细胞24h后,可明显抑制细胞的增殖;并且β-谷甾醇亦可促进细胞凋亡。
【关键词】：独角莲 β-谷甾醇 瘢痕疙瘩 增殖
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R622
【目录】：
- 中文摘要7-9
- 英文摘要9-11
- 前言11-12
- 材料和方法12-17
- 1 材料12
- 2 实验试剂12
- 3 实验仪器12-13
- 4 主要试剂及配制13
- 5 溶剂与药物配制方法13-14
- 6 实验方法14-15
- 7 细胞形态学观察及鉴定15
- 8 检测β-谷甾醇对细胞活性的影响15-16
- 9 FITC-Annexin V/PI 细胞流式技术检测相应浓度下的细胞凋亡率16
- 10 统计学分析16-17
- 结果17-20
- 1 原代、第三代细胞形态及其鉴定17-18
- 2 CCK8 法检测β-谷甾醇对细胞活性的影响18-19
- 3 FITC-Annexin V/PI 双染色对凋亡率的检测19-20
- 讨论20-25
- 1 细胞的原代培养20-22
- 2.溶剂的选取22-23
- 3 CCK-8(cell counting kit)比色法23
- 4 细胞流式实验23-24
- 5 β-谷甾醇作用机制24-25
- 结论25-26
- 参考文献26-28
- 综述28-36
- 参考文献33-36
- 致谢36-37
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