SMYD3对雌激素代谢酶转录调节作用机制分析

发布时间：2017-09-08 20:50

  本文关键词：SMYD3对雌激素代谢酶转录调节作用机制分析

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【摘要】：组蛋白甲基化酶SMYD3 (SET and MYND domain-containing protein 3)是乳腺癌等癌症中的重要调控因子,而雌激素信号通路的异常活跃以及雌激素代谢产物亦与乳腺癌的发生发展密切相关。然而,关于SMYD3在雌激素代谢中的作用,迄今为止尚未见有相关报道。鉴于此,本论文围绕SMYD3对CYP1A1、CYP1B1两种雌激素Ⅰ相代谢酶的转录调控作用机制,加以较为系统的研究,以期为乳腺癌的发生发展、预防治疗、合理用药及新药研发提供新的理论基础。本文首先用不同浓度的17β-雌二醇(E2)对人乳腺癌细胞MCF-7进行处理,RT-PCR、Western blot分析发现CYP1A1、CYP1B1的表达量均可随E2浓度的增加呈现剂量依赖性的上调。在采用RNA干扰特异性抑制内源性SMYD3表达后,CYP1A1、 CYP1B1的转录表达均进一步显著上升,同时高效液相色谱(HPLC)分析也证实细胞培养液中E2的残留量随之减少,而细胞内E2代谢产物20H-E2及40H-E2的产生量一则相应增多。此外,Real time RT-PCR及免疫组织化学分析表明SMYD3在乳腺癌细..胞及组织中的表达量均明显高于正常乳腺细胞及癌旁组织,而CYP1A1、CYP1B1 的表达水平则与SMYD3的表达量呈明显的负相关。这些结果表明：SMYD3可下调乳腺癌细胞中CYP1A1、CYP1B1的转录表达,并因此抑制雌激素的Ⅰ相代谢反应。接下来,通过对CYP1A1、CYP1B1启动子区域序列分析,发现二者均含有多个SMYD3结合位点(SBE)。荧光素酶报告分析及染色质免疫共沉淀(ChIP)实验结果显示,SMYD3可与CYP1A1启动子区-281位的SBE及CYP1B1启动子区-21位的SBE.结合,增强该区域的组蛋白H4K20甲基化修饰水平。将甲基化功能缺失的SMYD3突变体(SMYD3ANHS E)转染到MCF-7细胞中后,Real time RT-PCR分析显示SMYD3对CYP1A1的转录抑制作用基本解除,而对CYP1B1的转录抑制作用则部分解除。表明SMYD3对CYP1A1的转录抑制作用主要是通过催化CYP1A1启动子-281位SBE区域的组蛋白H4K20发生甲基化而产生的,而其对CYP1B1的转录抑制除了催化CYP1B1启动子区-21位SBE区域的组蛋白H4K20甲基化外,还存在其它机制。结合本课题组前期的miRNA表达谱芯片结果及生物信息学分析,发现在CYP1B1的3’UTR中存在有SMYD3下游靶基因miR-200c的结合位点(MRE),利用荧光素酶报告分析、RT-PCR、Western blot等实验,研究证实miR-200c可通过与CYP1B1 3'UTR的结合抑制其翻译过程。不仅如此,伴随着E2浓度的降低,MCF-7细胞中miR-200c的表达量呈现显著的增加,而CYP1B1则呈现出明显的下调,二者具有明显的负相关关系。这些结果表明SMYD3的下游靶基因miR-200c也是CYP1B1的重要负调控因子,其在E2及SMYD3对CYP1B1的转录调控过程中发挥了重要作用。
【关键词】：乳腺癌 SMYD3 CYP1A1 CYP1B1 雌激素 转录调控
【学位授予单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-9
• 1 前言9-17
• 1.1 雌激素及其代谢产物在乳腺癌中的作用9-11
• 1.1.1 雌激素9
• 1.1.2 雌二醇与乳腺癌的关系9-10
• 1.1.3 CYP1A1、CYP1B1介导的雌二醇代谢及其与乳腺癌的关系10-11
• 1.2 组蛋白甲基化与组蛋白甲基化酶SMYD311-14
• 1.2.1 表观遗传及组蛋白甲基化概述11
• 1.2.2 SMYD3的基本特征11-12
• 1.2.3 SMYD3的转录调节作用机制12-13
• 1.2.4 SMYD3在乳腺癌中的作用13-14
• 1.3 miR-200c与乳腺癌的关系14-15
• 1.3.1 microRNAs的机制概述14-15
• 1.3.2 miR-200家族概述及其与乳腺癌的关系15
• 1.4 本课题的主要内容、研究目的及意义15-17
• 2 材料与方法17-46
• 2.1 实验材料17-26
• 2.1.1 材料与试剂17-19
• 2.1.2 常用溶液及培养基配制方法19-25
• 2.1.3 实验仪器25-26
• 2.2 实验方法26-46
• 2.2.1 细胞培养26-27
• 2.2.2 细胞转染27-28
• 2.2.3 逆转录PCR(RT-PCR)及实时荧光定量PCR(Real time PCR)28-33
• 2.2.4 蛋白质免疫印记(Western blot)33-34
• 2.2.5 荧光素酶活性检测(Luciferase reporter assay)34-35
• 2.2.6 染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)35-37
• 2.2.7 免疫荧光技术及免疫组织化学37-38
• 2.2.8 大肠杆菌感受态细胞制备38
• 2.2.9 CYP1B1 YUTR荧光素酶报告质粒构建38-43
• 2.2.10 点突变质粒的构建43-45
• 2.2.11 雌激素及其代谢产物的高效液相色谱分析(HPLC)45
• 2.2.12 统计分析方法45-46
• 3 结果与讨论46-66
• 3.1 E_2及SMYD3对雌激素代谢酶的转录调控作用分析46-49
• 3.1.1 E_2对乳腺癌细胞中CYP1A1、CYP1B1和COMT的转录调控作用分析46
• 3.1.2 SMYD3对CYP1A1、CYP1B1和COMT的转录调控作用分析46-49
• 3.2 乳腺癌细胞及临床组织样本中的表达相关性分析49-50
• 3.2.1 SMYD3与CYP1A1、CYP1B1在乳腺细胞中及相关性分析49
• 3.2.2 临床乳腺癌组织样本中的表达水平及相关性分析49-50
• 3.3 SMYD3对雌激素代谢影响情况的HPLC分析50-52
• 3.3.1 SMYD3对MCF-7细胞外E_2代谢消耗的影响情况分析50-51
• 3.3.2 SMYD3对MCF-7细胞内2-OHE_2和4-OHE_2生成量的影响情况分析51-52
• 3.4 SMYD3对CYP1A1、CYP1B1转录调控作用机制分析52-59
• 3.4.1 SMYD3对CYP1A1、CYP1B1启动子转录调控作用分析52-57
• 3.4.2 组蛋白甲基化在SMYD3对CYP1A1、CYP1B1的转录调控中的作用57-59
• 3.5 miR-200c在SMYD3抑制CYP1B1转录中的作用分析59-64
• 3.5.1 miR-200c对CYP1B1的3'UTR转录调控作用分析59-63
• 3.5.2 miR-200c对CYP1B1 mRNA及蛋白质水平的影响情况分析63-64
• 3.5.3 E_2对miR-200c转录调控作用分析64
• 3.6 SMYD3对雌激素代谢酶CYP1A1、CYP1B1转录调节机制小结64-66
• 4 结论66-67
• 5 展望67-68
• 6 参考文献68-75
• 7 攻读硕士期间发表论文情况75-76
• 8 致谢76

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