萝卜硫素对2型糖尿病小鼠耳蜗毛细胞退行性变的保护作用及机制研究

发布时间：2017-09-08 21:07

  本文关键词：萝卜硫素对2型糖尿病小鼠耳蜗毛细胞退行性变的保护作用及机制研究

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【摘要】：目的：糖尿病性耳聋是一种以高频为主,外毛细胞散在缺失为特征的感音神经性耳聋。长期高血糖及其代谢产物导致的氧化应激可激活多种凋亡信号通路造成耳蜗细胞的不可逆性损害,是感音神经性耳聋发生发展的关键因素。耳蜗的独特结构及维持听功能正常时易受到自由基的氧化损伤。大量听力学检测发现糖尿病患者毛细胞出现退行性变。硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)是体内最主要的抗氧化剂之一,在减少细胞凋亡和抗氧化方面起着关键的作用。萝卜硫素(SF)是广泛存在于西兰花等十字花科蔬菜及莱菔子等食／药用植物中的抗氧化诱导剂。NF-E2-相关因子2(Nrf2)是核心转录蛋白,能结合ARE区域后调节II相代谢酶基因的转录。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是生物体内关键的信号传导系统之一,参与介导多种细胞生物过程。研究证实SF能通过上调Trx的表达对Tub小鼠耳蜗毛细胞的退变起保护作用。本课题通过建立2型糖尿病小鼠模型,探讨萝卜硫素(SF)保护糖尿病之高糖所致的耳蜗毛细胞退行性变性的保护作用机制,以期为临床预防和治疗糖尿病性耳聋提供新理论依据及治疗指导方案。方法：1.建立2型糖尿病动物模型首先根据国际公认的建模标准建立2型糖尿病小鼠模型,以随机空腹血糖7.8mmol/L及出现胰岛素抵抗为建模成功。将Balb/c小鼠分为2型糖尿病组(T2DM)与正常组(control)。继之以不同剂量SF (0.5mg/kg,1mg/kg,2mg/kg)及同一剂量的SF不同给药时间(5d,10d,15d)分别处理T2DM组小鼠后,检测T2DM组和Control组小鼠耳蜗中Trx基因和蛋白的表达水平,以确定最佳给药剂量和有效用药时间。最后用SF和Trx的抑制剂(PX-12)对Control组和T2DM两组进行相同处理,分为对照组、治疗组(SF)、和实验组(SF+PX-12)。2.我们通过耳蜗毛细胞琥珀酸脱氢酶(succinic dehydrogenase, SDH)染色,进行耳蜗毛细胞计数以及耳蜗切片HE染色对耳蜗组织形态学进行观察分析；采用耳蜗石蜡切片免疫荧光组织化学的方法检测Trx与ASK1在耳蜗组织的定位及表达情况：采用Real-time PCR检测耳蜗组织中Trx及Txnip基因水平,用Western blot方法检测小鼠耳蜗组织中Trx, Nrf2,p-Erk,及细胞凋亡调节蛋白激酶ASK1的蛋白表达水平。结果：1.SF对T2DM组小鼠耳蜗组织中Trx基因和蛋白水平的影响。以不同剂量的SF(0.5mg/kg,1mg/kg,2mg/kg)处理T2DM组小鼠后,Western blot检测Trx蛋白水平结果显示,SF各剂量处理组与T2DM对照组比较Trx的表达均有不同程度的升高(p0.05,p0.01,p0.05)。其中以1.Omg/kg剂量组最为显著。Real-time PCR检测结果与Western blot检测结果趋势一致,各剂量组耳蜗组织中Trx基因表达较T2DM对照组均有所上调,以1mg/kg剂量组最为显著(p0.01)。选用SF 1mg/kg剂量以不同时间(5d,10d,15d)处理T2DM组小鼠后,Real-timePCR检测与Western blot检测结果发现,T2DM组小鼠耳蜗中Trx的表达水平与用药时间成正相关,其中以15天效果最佳(p0.01)。2.SF与PX-12对T2DM小鼠耳蜗毛细胞退行性变的作用及机制。2。1 SF及PX-12对T2DM小鼠耳蜗毛细胞退行性变的影响采用耳蜗毛细胞琥珀酸脱氢酶(succinic dehydrogenase, SDH)染色法,小鼠耳蜗顶回至底回以相等距离(200um)计数毛细胞缺失数,SDH染色显色细胞为活细胞。观察可见各T2DM组,距顶回70%处外毛细胞排列不规则,开始明显缺失。统计结果显示,各T2DM组与正常组比较外毛细胞数均有不同程度的减少而内毛细胞数减少轻微。其中T2DM对照组与正常组比较外毛细胞数显著减少(p0.00I,n=3),内毛细胞均数亦有所减少(p0.05,n=3)。T2DM组中单纯给与SF组与T2DM对照组比较外毛细胞均数有明显增加(p0.001,n=3),内毛细胞数有所增加(p0.05,n=3)。T2DM组中SF和PX-12联合作用组与单纯给与SF组比较外毛细胞数减少(p0.01,n=3),内毛细胞数也有所减少(p0.05,n=3)。从耳蜗组织HE染色切片观察毛细胞缺失趋势与毛细胞SDH染色计数结果一致。2.2荧光免疫组化法观察SF与PX-12对T2DM小鼠耳蜗组织中Trx和ASK1表达的影响荧光免疫组化结果分析显示,Trx与ASK1的表达主要位于小鼠耳蜗毛细胞中,T2DM组小鼠与正常组小鼠比较耳蜗毛细胞中Trx表达明显减弱,而ASK1的表达明显增强。T2DM组中单纯给与SF组与T2DM对照组比较耳蜗毛细胞中Trx表达明显增强,ASK1的表达则明显减弱。T2DM组中SF和PX-12联合作用组与单纯给与SF组比较耳蜗毛细胞中Trx的表达有所减弱,ASK1的表达有所增强。2.3 SF与PX-12对T2DM小鼠耳蜗中Trx、Txnip与ASK1,Nrf2与P-Erk表达的影响用Real-time PCR的方法检测各组耳蜗组织中的Trx和Txnip的基因表达水平,检测结果分析显示,与正常对照组比较,T2DM组小鼠耳蜗组织中的Trx基因表达明显下调(p0.01,n=3),Txnip基因表达明显上调(p0.01,n=3)。单纯给与SF处理的正常组小鼠与正常对照组比较其耳蜗中的Trx基因表达有所上调(p0.05n=3),Txnip的表达有所下调(p0.05,n=3)。SF与PX-12联合处理的正常组小鼠与单纯给与SF处理的正常组小鼠比较Trx基因表达有所下调(p0.05,n=3),Txnip的表达有所上调(p0.05,n=3)。单纯给与SF处理的T2DM组小鼠与T2DM对照组比较其耳蜗组织中的Trx基因表达有所上调(p0.05,n=3),Txnip的表达有所下调(p0.05,n=3)。SF与PX-12联合处理的T2DM组小鼠与单纯给与SF处理的T2DM组小鼠比较Trx基因表达有所下调(p0.05,n=3),Txnip的表达有所上调(p0.05,n=3)。Western blot检测结果显示,与正常对照组比较,T2DM组小鼠耳蜗组织中的Trx、Nrf2和p-Erk的蛋白表达水平均有明显下调(p0.01,p0.01,p0.05；n=3),ASK1的表达明显上调(p0.01,n=3)。单纯给与SF处理的正常组小鼠与正常对照组比较其耳蜗组织中的Trx、Nrf2和p-Erk蛋白表达均有上调(p0.05,p0.05,p0.05；n=3),ASK1的表达有所下调(p0.01,n=3)。SF与PX-12联合处理的正常组小鼠与单纯给与SF处理的正常组小鼠比较Trx、Nrf2和p-Erk表达有不同程度的下调(p0.01,p0.05,p0.05；n=3),ASKI的表达有所上调(p0.05,n=3)。单纯给与SF处理的T2DM组小鼠与T2DM对照组比较其耳蜗中的Trx、Nrf2和p-Erk表达有不同程度的上调(p0.05,p0.05,p0.01；n=3),ASK1的表达有所下调(p0.05,n=3)。SF与PX-12联合处理的T2DM组小鼠与单纯给与SF处理的T2DM组小鼠比较Trx、Nrf2和p-Erk表达有不同程度的下调(p0.05,p0.01,p0.05；n=3),ASK1的表达有所上调(p0.05,n=3)。说明SF通过作用于p-Erk/Nrf2抗氧化信号转导通路上调Trx的表达,抑制ASK1引起的凋亡信号通路的激活,从而对糖尿病耳蜗毛细胞的退变起保护作用。结论：1.糖尿病小鼠耳蜗底回外毛细胞丢失显著,毛细胞中Trx表达下调,而Txnip、ASK1表达明显上调。2.SF能够有效上调耳蜗毛细胞的Trx表达从而抑制Txnip的活性以及ASK1介导的下游凋亡通路的激活,对糖尿病小鼠耳蜗毛细胞的退变起到保护作用。3.p-Erk/Nrf2抗氧化酶链与SF介导Trx表达的上调有关
【关键词】：萝卜硫素 硫氧还蛋白 转录因子Nrf2 糖尿病性耳聋 毛细胞退行性变
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.1;R764.43
【目录】：

• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-16
• 前言16-18
• 第一部分 萝卜硫素对2型糖尿病小鼠耳蜗毛细胞退行性变的保护作用18-29
• 前言18
• 材料和方法18-26
• 结果26-28
• 讨论28-29
• 第二部分 萝卜硫素对2型糖尿病小鼠耳蜗毛细胞退行性变的保护机制29-40
• 前言29
• 材料与方法29-33
• 结果33-38
• 讨论38-40
• 结论40-41
• 参考文献41-45
• 综述45-51
• 参考文献48-51
• 附录51-52
• 攻读学位期间发表文章情况52
• 致谢52

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