薯蓣皂苷抗肝脑缺血再灌注损伤的生物学活性及分子机制研究

发布时间：2017-09-20 03:34

  本文关键词：薯蓣皂苷抗肝脑缺血再灌注损伤的生物学活性及分子机制研究

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【摘要】：目的:考察薯蓣皂苷(dioscin)抗肝脑缺血再灌注损伤的生物学活性并探讨可能的分子作用机制。方法:(1)在薯蓣皂苷抗肝缺血再灌注损伤(hepatic I/R injure)研究中,采用70%Wistar大鼠肝缺血模型。预防组大鼠随机分假手术组、模型组和高中低剂量给药组(薯蓣皂苷,60、40和20 mg/kg),每组10只,每天口服给予薯蓣皂苷1次,连续给药7天;治疗组大鼠随机分假手术组、模型组和给药组(薯蓣皂苷,60 mg/kg),每组20只,手术前2 h口服给予薯蓣皂苷1次,术后每天给药一次。检测血清ALT、AST水平,结合组织病理学和生存率等指标来评价薯蓣皂苷对肝缺血再灌注损伤的保护作用;测定肝组织中SOD、MDA、CAT、GSH-Px、GSH、NO、iNOS和TNOS含量来考察薯蓣皂苷的抗氧化能力;采用DAPI、TUNEL和DAB分析法考察薯蓣皂苷的抗凋亡作用;采用免疫组织化学、western blotting及real-time PCR方法考察薯蓣皂苷对凋亡和炎症信号通路相关蛋白和基因表达影响。(2)在薯蓣皂苷抗脑缺血再灌注损伤(cerebral I/R injure)研究中,体外建立PC12细胞和原代神经元细胞的OGD/R模型,薯蓣皂苷(200、100和50 ng/m L)预处理12 h,用MTT法、LDH、NeuN的释放测定来评价薯蓣皂苷对OGD/R损伤细胞的保护作用;体内建立SD大鼠MCAO的脑缺血再灌注模型,预防组大鼠随机分假手术组、模型组和薯蓣皂苷高中低剂量给药组(60、40和20 mg/kg),每组10只,每天口服给予薯蓣皂苷1次,连续给药7天;治疗组大鼠随机分假手术组、模型组和薯蓣皂苷高中低剂量给药组(60、40和20 mg/kg),每组10只,建立MCAO模型前2 h口服给予薯蓣皂苷1次,术后每天给药一次;以预防组的神经功能缺损评分、大脑ttc染色、大脑相关指数、大脑组织ldh释放水平、组织病理学、大脑细胞标志物(neun、gfap和kir4.1)测定和tunel检测,以及治疗组的神经功能缺损评分和生存率来评价薯蓣皂苷对mcao大鼠的脑保护作用;采用westernblotting及real-timepcr方法考察薯蓣皂苷对大脑中涉及hmgb-1/tlr4炎症信号通路相关的蛋白和基因表达影响;并采用hmbg-1、tlr4sirna干扰和全基因过表达实验分别验证薯蓣皂苷是否是通过抑制hmgb-1/tlr4信号通路抗脑缺血再灌注损伤。结果:(1)在抗肝缺血再灌注损伤实验中,预防组实验发现,与模型组相比,薯蓣皂苷能显著降低血清alt和ast活性,减轻由肝缺血再灌注损伤导致的肝组织损伤;治疗组实验发现,与模型组相比,薯蓣皂苷(60mg/kg)能显著降低不同时间点血清alt和ast酶活性,提高大鼠生存率。同时,薯蓣皂苷可显著降低mda、inos、tnos、no含量,升高gsh、gsh-px、sod、cat水平,改善氧化应激,并能够减少tunel阳性细胞数,减轻肝细胞的凋亡;分子机制研究表明薯蓣皂苷能够降低mapks磷酸化水平,下调cyp2e1、il-1β、il-6、tnf-α、icam-1、mip-1α、mip-2、nf-κb、ap-1、cox-2和hmgb-1等炎症因子的基因或蛋白表达水平,降低parp、caspase-9、caspase-3、bak、p53、fas和fasl等凋亡蛋白或基因表达水平,上调bcl-2和bcl-x的蛋白表达水平。(2)在抗脑缺血再灌注损伤的实验中,体外实验发现,与ogd/r模型组相比,薯蓣皂苷能显著升高pc12和原代神经元的细胞活力,减少ldh释放,增加原代神经元的neun释放;体内预防实验中,与模型组相比,薯蓣皂苷能显著改善mcao大鼠的大脑神经功能缺损评分、减少ttc染色阳性区域、大脑ldh释放水平、大脑相关指数以及大脑组织的gfap、kir4.1和tunel阳性细胞数,增加脑组织neun阳性细胞数;体内治疗实验中,与模型组相比,薯蓣皂苷可以改善mcao大鼠的大脑神经功能缺损评分,提高大鼠生存率。分子机制研究表明薯蓣皂苷抗脑缺血再灌注损伤是通过抑制hmgb-1的核转移,降低hmgb-1蛋白表达水平,从而抑制tlr4炎症信号通路的相关蛋白nf-κb、ap-1、mapks、p-stat3和炎症因子;进一步的hmgb-1、tlr4sirna和全基因过表达实验结果证明薯蓣皂苷抗脑缺血再灌注损伤的作用靶点是hmgb-1/tlr4信号通路。结论:(1)薯蓣皂苷是通过调节氧化应激水平、抗炎和抗凋亡等途径来实现抗肝缺血再灌注损伤的生物学作用;(2)薯蓣皂苷有较好的抗脑缺血再灌注损伤作用,这种作用是通过抑制HMGB-1/TLR4信号通路来实现的。总之,薯蓣皂苷在抗肝脑缺血再灌注损伤方面具有较好的生物学活性,值得深入探索和研究。
【关键词】：薯蓣皂苷 肝缺血再灌注损伤 脑缺血再灌注损伤 氧化应激 抗凋亡 抗炎
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R285.5
【目录】：

• 中文摘要10-13
• 英文摘要13-16
• 前言16-18
• 第一部分：薯蓣皂苷抗肝缺血再灌注损伤的生物学 活性及分子机制研究18-33
• 前言18
• 材料和方法18-24
• 1. 材料18-19
• 1.1. 实验动物18
• 1.2. 试剂和药品18-19
• 1.3. 仪器19
• 2. 实验方法19-24
• 2.1. 药物配制19
• 2.2. 实验动物分组与处理19-20
• 2.3. 血清和肝生化指标测定20
• 2.4. 组织病理学检查20
• 2.5. DAPI染色20-21
• 2.6. TUNEL法检测肝细胞凋亡21
• 2.7. 免疫组织化学分析21-22
• 2.8. Real-time PCR分析22
• 2.9. Western blotting分析22-24
• 2.10. 统计学分析24
• 结果24-31
• 3.1. 薯蓣皂苷预防给药对大鼠组织病理学和血清学指标的影响24-25
• 3.2. 薯蓣皂苷治疗给药对大鼠血清学指标和生存率的影响25
• 3.3. 薯蓣皂苷对肝缺血再灌注损伤大鼠氧化应激的影响25
• 3.4. 薯蓣皂苷对肝缺血再灌注损伤大鼠肝细胞的影响25-27
• 3.5. 薯蓣皂苷对肝缺血再灌注损伤大鼠的HMGB-1、PARP、Caspase-9蛋白表达的影响27-28
• 3.6. 薯蓣皂苷对肝缺血再灌注损伤大鼠炎症通路中相关分子表达的影响28
• 3.7. 薯蓣皂苷对肝缺血再灌注损伤大鼠凋亡通路中相关分子表达的影响28-29
• 3.8. 薯蓣皂苷对MAPKs相关分子表达的影响29-31
• 讨论31-32
• 结论32-33
• 第二部分 薯蓣皂苷抗脑缺血再灌注损伤的生物学活性及分子机制研究33-66
• 前言33
• 材料和方法33-43
• 1. 材料33-35
• 1.1. 细胞33
• 1.2. 实验动物33
• 1.3. 试剂和药品33-34
• 1.4. 仪器34-35
• 2. 实验方法35-43
• 2.1. 药物配制35
• 2.2. 细胞培养35-37
• 2.3. 细胞毒性测定37
• 2.4. 细胞OGD/R模型建立37
• 2.5. 细胞活力分析37-38
• 2.6. 细胞LDH释放测定38
• 2.7. 原代神经元细胞Neu N释放检测38
• 2.8. 实验动物分组与处理38-39
• 2.9. 脑梗死体积和大脑相关指数的测定39
• 2.10. 大脑组织LDH的测定39
• 2.11. 神经功能缺损评分39
• 2.12. 组织病理学检查39-40
• 2.13. TUNEL法检测脑细胞凋亡40
• 2.14. 免疫组织化学分析40-41
• 2.15. Real-time PCR分析41
• 2.16. Western blotting分析41
• 2.17. 最佳HMGB-1 和TLR4 siRNA干扰序列选择41-42
• 2.18. HMGB-1 和TLR4 si RNA转染实验42-43
• 2.19. HMGB-1 和TLR4过表达全基因转染实验43
• 2.20. 统计学分析43
• 结果43-63
• 3.1. 薯蓣皂苷对PC12细胞和原代神经元细胞的细胞毒性43
• 3.2. 薯蓣皂苷对OGD/R损伤的PC12细胞和原代神经元细胞活力影响43-45
• 3.3. 薯蓣皂苷对OGD/R损伤的PC12细胞和原代神经元细胞形态学的影响45
• 3.4. 薯蓣皂苷预防给药对MCAO损伤的大鼠神经功能缺损评分的影响45-46
• 3.5. 薯蓣皂苷预防给药对脑梗死体积、相关脑指数和脑组织LDH的影响46-48
• 3.6. 薯蓣皂苷治疗给药对大鼠神经功能及生存率的影响48
• 3.7. 薯蓣皂苷对MCAO大鼠组织病理学的影响48-49
• 3.8. 薯蓣皂苷对MCAO大鼠炎症因子的影响49
• 3.9. 薯蓣皂苷对HMGB-1/TLR4信号通路相关蛋白的影响49-51
• 3.10. 薯蓣皂苷对PC12细胞和原代神经元细胞炎症因子的影响51
• 3.11. 薯蓣皂苷对PC12细胞和原代神经元细胞MMP-9 和HMGB-1 表达的影响51-52
• 3.12. 薯蓣皂苷对PC12细胞和原代神经元细胞TLR4信号通路相关蛋白表达的影响52
• 3.13. PC12细胞和原代神经元细胞最佳HMGB-1 和TLR4 siRNA的选择52-53
• 3.14. 薯蓣皂苷对HMGB-1 siRNA神经保护作用的影响53-56
• 3.15. HMGB-1 DNA逆转薯蓣皂苷的神经保护作用56-57
• 3.16. 薯蓣皂苷对TLR4 si RNA神经保护作用的影响57-60
• 3.17. TLR4 DNA逆转薯蓣皂苷的神经保护作用60-63
• 讨论63-65
• 结论65-66
• 参考文献66-74
• 综述74-96
• 参考文献86-96
• 攻读学位期间发表文章情况96-97
• 附录97-99
• 致谢99-100

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