管盖芯片在转基因和HPV分型检测中的初步应用

发布时间：2017-09-20 01:42

  本文关键词：管盖芯片在转基因和HPV分型检测中的初步应用

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【摘要】：基因芯片是一种通量高、特异性强的基因水平的检测平台,被广泛应用于杂交测序、基因差异性表达、SNP位点检测、药物筛选、疾病诊断等。基因芯片的灵敏度受到多种因素的影响,要达到提高管盖芯片灵敏度的要求,必须对管盖芯片的整个检测体系进行优化。本课题是旨在提高人乳头瘤病毒分型和转基因大豆在管盖芯片上检测的灵敏度,使其灵敏度达到100copies/μl。本文的研究内容如下：(1)检测平台的优化,扩增检测一体化的体系的构建。为了建立扩增检测一体化的体系,首先针对整个实验中影响杂交效果三个主要步骤进行了优化处理,其包括PCR扩增体系、杂交反应、芯片制备,并且针对HPV扩增的通用引物对不同HPV分型模板的扩增效率不一的情况,增加了几对具有特异扩增效率较高的引物对。关于PCR扩增体系的优化有引物的设计、不对称PCR扩增的探究。优化引物设计是为筛选出扩增特异性最好的PCR扩增产物,提高特异性杂交的的效率；不对称PCR扩增的探究是为了获得较多带荧光标记单链靶序列,即增加了杂交反应的待测样品的量,为杂交反应做了好铺垫。为了杂交反应拥有较好的杂交效果,对杂交的时间、杂交基底、质控探针浓度进行了优化处理,同时为了确保芯片的质量,在芯片上增加了位置质控、杂交质控等。(2)以管盖芯片为检测平台,对转基因大豆进行检测。在100个copies/μl下能够成功的扩增转基因大豆的MON89788基因、GTS-40-3-2基因、A2704-12基因、A5547-127基因及内标Lectin基因。实验使用该平台,对其进行基因检测,在100个copies/μl下能够检测到这个四个基因。转基因大豆的杂交信号的信噪比值都达到了预期标准要求。(3)以管盖芯片为检测平台,对HPV进行分型检测。本论文通过使用该平台能够在100 copies/μl下,能成功的进行PCR扩增有HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、26、53、66、6、11、40、42、43、44、61、70、72、81、83,并能通过杂交进行HPV分型检测。对HPV16、18、31、33、35、39、40、45、44、61、70、72、81杂交信号进行性噪比评价分析,HPV的性噪比值都在都大约等于1.5,除了HPV45的性噪比较低,HPV的杂交信号的SNR值达到了预期的信噪比要求。
【关键词】：基因芯片 管盖芯片 人乳头瘤病毒 转基因大豆
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q789;R440
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 第一章 绪论9-27
• 1.1 基因芯片技术9
• 1.2 基因芯片技术简介9-15
• 1.2.1 基因芯片的制备9-10
• 1.2.2 基因芯片技术的检测原理10-11
• 1.2.3 基因芯片技术的应用及存在的问题11-12
• 1.2.4 点突变及单核苷酸多态性(SNP)检测12-13
• 1.2.5 药物筛选13-15
• 1.3 管盖芯片15-16
• 1.3.1 管盖芯片简介15
• 1.3.2 管盖芯片应用15-16
• 1.4 转基因研究进展16-22
• 1.4.1 转基因简介16-17
• 1.4.2 转基因检测及意义17-21
• 1.4.3 转基因大豆检测的研究进展21-22
• 1.5 人乳头瘤病毒研究进展22-25
• 1.5.1 人乳头瘤病毒的简介22-23
• 1.5.2 人乳头瘤病毒的检测及意义23-25
• 1.6 本课题研究目的及内容25-27
• 1.6.1 研究目的25
• 1.6.2 研究内容25-27
• 第二章 建立扩增检测一体化的体系27-40
• 2.1 引言27
• 2.2 实验材料27-28
• 2.2.1 实验样品27
• 2.2.2 实验试剂27-28
• 2.2.3 实验仪器28
• 2.3 PCR扩增28-31
• 2.3.1 PCR扩增的引物设计28-29
• 2.3.2 多重PCR扩增29
• 2.3.3 灵敏度扩增优化实验29-31
• 2.3.4 内标引物扩增实验31
• 2.4 基因芯片的设计、制作及检测过程中的优化31-35
• 2.4.1 探针的设计31-32
• 2.4.2 基因芯片的制备过程32
• 2.4.3 芯片阵列设计32
• 2.4.4 芯片的点样及处理32-33
• 2.4.5 基因芯片交杂的优化33-35
• 2.5 不对称PCR扩增优化35-37
• 2.6 质粒验证37-38
• 2.6.1 转基因大豆质粒验证37-38
• 2.6.2 HPV质粒验证38
• 2.7 结果与讨论38-40
• 第三章 管盖芯片检测平台上的应用40-55
• 3.1 引言40
• 3.2 管盖芯片与传统的基因芯片的优势比较40-41
• 3.3 管盖芯片的制备41
• 3.4 管盖芯片检测的技术路线41-42
• 3.5 管盖芯片在转基因大豆检测中的应用42-46
• 3.5.1 实验材料42-43
• 3.5.2 实验材料的处理43
• 3.5.3 转基因大豆的引物及探针43-44
• 3.5.4 实验过程44-45
• 3.5.5 实验结果与讨论45-46
• 3.6 管盖芯片在人乳头瘤病毒分型检测中的应用46-52
• 3.6.1 实验材料46-47
• 3.6.2 实验材料处理及保存47-48
• 3.6.3 人乳头瘤病毒的引物及探针48-49
• 3.6.4 实验过程49-50
• 3.6.5 实验结果与讨论50-52
• 3.7 管盖芯片灵敏性实验52-53
• 3.7.1 实验材料52
• 3.7.2 实验过程52-53
• 3.7.3 实验结果与讨论53
• 3.8 小结53-55
• 第四章 总结与展望55-57
• 4.1 论文工作的主要内容和研究成果55
• 4.2 后续工作需要解决的问题55-57
• 参考文献57-63
• 作者简介63-65
• 致谢65

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本文编号：885200