倭蜂猴粪便微生物多样性研究及功能基因的生物信息学分析

发布时间：2017-10-10 16:46

  本文关键词：倭蜂猴粪便微生物多样性研究及功能基因的生物信息学分析

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【摘要】：倭蜂猴是国家I类重点保护野生动物,其肠道中存在的微生物群落是长期进化的结果,与动物的食性、机体免疫、营养需求等有密切关系。为了解倭蜂猴胃肠道环境中微生物的多样性,阐明微生物在该环境中的群落分布、种群功能、微生物的进化及其在地球物质循环过程中的作用,以及促进微生物资源的开发,本文结合传统分子生态学方法、宏基因组学技术和生物信息学分析,首先较为全面地研究倭蜂猴粪便微生物的组成与潜在功能,为促进该珍稀野生动物的保护及其胃肠道微生物的利用奠定基础,并为进一步了解人类及其胃肠道微生物的进化提供理论依据;其次,研究倭蜂猴粪便微生物的芳香族化合物代谢基因,为进一步认识和丰富环境中芳香族化合物代谢提供理论依据,为倭蜂猴粪便微生物基因资源的开发利用奠定基础。研究结果总结如下:1.基于16S rRNA基因的倭蜂猴粪便菌群多样性研究以倭蜂猴粪便为样本,利用16S rDNA克隆和测序的方法,研究了倭蜂猴粪便中细菌群落的组成。结果表明,厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)是倭蜂猴粪便菌群中的优势菌,尤其以假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌最多,并发现了大量以前还未鉴定的细菌。2.基于宏基因组学的倭蜂猴粪便微生物组成研究利用鸟枪法宏基因组焦磷酸测序及比较宏基因组技术,全面研究了倭蜂猴粪便微生物的物种组成及其与人和其它动物的异同。结果表明拟杆菌门(Bacteroidetes)是最丰富的细菌门,其次是变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)。古菌、真菌和病毒是倭蜂猴粪便微生物组中的次要种群,所有古菌都归属于广古菌门(Euryarchaeota)和泉古菌门(Crenarchaeota),其中产甲烷古菌最为丰富和多样。倭蜂猴粪便微生物组中共存在子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)和微孢子虫门(Microsporidia)三个门的真菌,病毒来源的序列只有约0.1%,且全部都是噬菌体。物种组成为基础的比较宏基因组研究表明,Bacteroidetes、Proteobacteria、Actinobacteria和Firmicutes在倭蜂猴、人类和其它动物的胃肠道组中都占优势,然而其所占相对比例不同,且倭蜂猴比人类和其他动物含有更多疣微菌门的细菌。双向聚类比较表明,倭蜂猴和小鼠肠道的微生物群落结构最为相似。3.基于宏基因组学的倭蜂猴粪便微生物潜在功能及代谢研究利用鸟枪法宏基因组焦磷酸测序及比较宏基因组技术,研究了倭蜂猴粪便微生物的潜在功能及其与人和其它动物的异同。基于SEED subsystems的功能分类表明,糖代谢是倭蜂猴粪便微生物宏基因组中最丰富的功能类别;基于COG蛋白库的功能分类表明,Metabolism所占比例最高,其中氨基酸转运和代谢(E)丰度最高;基于CAZymes的注释表明,CAZymes家族中GH所占比例最高,其次是GT、CE、PL和CBM,其中属于GT 2的序列最丰富,其次是GH3和GH 2;KEGG代谢途径注释表明,倭蜂猴粪便微生物宏基因组中存在大多数苯甲酸代谢所需酶类。功能代谢为基础的比较宏基因组研究表明,倭蜂猴粪便微生物宏基因组中具有更高丰度和多样性的芳香族化合物代谢系统。双向聚类比较表明,虽然倭蜂猴和小鼠肠道系统的微生物群落结构组成最相似,但其功能却有差异,倭蜂猴与人、鸡和狗聚在一起,而与鼠和牛分开。4.倭蜂猴粪便微生物宏基因组文库构建及芳香族化合物代谢基因的研究通过构建宏基因组Fosmid文库,采用功能筛选从中获得能代谢芳香族化合物的43个阳性克隆,对其质粒进行高通量测序,研究了倭蜂猴粪便微生物的芳香族化合物代谢基因。结果表明,获得的芳香族化合物代谢酶类基因主要来源于γ-Proteobacteria和Actinobacteria,含盖了芳香族化合物的好氧和杂合代谢途径,并从中获得一个来自Brevibacterium sp.的完整苯乙酸代谢基因簇。与其它放线菌门及革兰氏阳性菌的苯乙酸代谢基因簇相比,该基因簇的基因结构和分布位置存在明显差异。生物信息学分析表明,paaK的ORF全长1296bp,编码431个氨基酸,与其它属细菌来源的苯乙酰辅酶A连接酶的氨基酸序列相似性低于65%且系统进化距离较远,具有典型的AMP binding motif以及PA-CoA ligase的保守区DIYGLSE和YRTRD。
【关键词】：倭蜂猴 粪便微生物 宏基因组 芳香族化合物代谢 高通量测序
【学位授予单位】：云南师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S865.31;Q93
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-8
• 术语、符号说明8-14
• 第一章 绪论14-49
• 1.1 研究目的和意义14-15
• 1.2 国内外研究现状15-47
• 1.2.1 动物胃肠道微生物15-30
• 1.2.2 宏基因组学30-44
• 1.2.3 芳香族化合物微生物降解代谢的研究进展44-47
• 1.3 研究的内容及技术路线47-49
• 1.3.1 研究内容47-48
• 1.3.2 技术路线48-49
• 第二章 基于 16S rRNA基因的倭蜂猴粪便菌群多样性研究49-64
• 2.1 引言49
• 2.2 实验材料与方法49-55
• 2.2.1 倭蜂猴粪便样品的采集49
• 2.2.2 菌种49
• 2.2.3 培养基49-50
• 2.2.4 试剂与仪器50
• 2.2.5 细菌 16S rRNA基因扩增引物50
• 2.2.6 倭蜂猴粪便微生物基因组DNA的提取50-52
• 2.2.7 倭蜂猴粪便细菌 16S r DNA文库构建及系统发育分析52-55
• 2.3 结果和分析55-61
• 2.3.1 倭蜂猴粪便微生物基因组DNA的提取55-56
• 2.3.2 PCR扩增细菌 16S rDNA56-57
• 2.3.3 16S rDNA克隆、转化和文库构建57
• 2.3.4 菌落PCR验证阳性克隆57-58
• 2.3.5 阳性克隆的PCR-RFLP分析58
• 2.3.6 系统进化分析58-61
• 2.4 讨论61-64
• 第三章 基于宏基因组学的倭蜂猴粪便微生物组成研究64-81
• 3.1 引言64
• 3.2 实验材料与方法64-66
• 3.2.1 倭蜂猴粪便样品的采集64
• 3.2.2 DNA提取及Shotgun Pyrosequencing64-65
• 3.2.3 生物信息学和统计学分析65-66
• 3.3 结果和分析66-79
• 3.3.1 倭蜂猴粪便微生物基因组DNA的提取66
• 3.3.2 Shotgun Pyrosequencing66-69
• 3.3.3 倭蜂猴粪便细菌的进化分析69-72
• 3.3.4 倭蜂猴粪便真菌的进化分析72-73
• 3.3.5 倭蜂猴粪便古菌的进化分析73-75
• 3.3.6 倭蜂猴粪便病毒的进化分析75-76
• 3.3.7 倭蜂猴粪便微生物组成的比较宏基因组分析76-79
• 3.4 讨论79-81
• 第四章 基于宏基因组学的倭蜂猴粪便微生物潜在功能及代谢研究81-99
• 4.1 引言81
• 4.2 实验材料与方法81-83
• 4.2.1 倭蜂猴粪便样品的采集81
• 4.2.2 DNA提取及Shotgun Pyrosequencing81-82
• 4.2.3 生物信息学和统计学分析82-83
• 4.2.4 KEGG代谢途径分析83
• 4.3 结果与分析83-97
• 4.3.1 倭蜂猴粪便微生物宏基因组的SEED subsystems功能分类83-84
• 4.3.2 倭蜂猴粪便微生物宏基因组的COG功能分类84-85
• 4.3.3 倭蜂猴粪便微生物功能的比较宏基因组分析85-90
• 4.3.4 倭蜂猴粪便微生物宏基因组的碳水化合物活性酶类注释90-95
• 4.3.5 KEGG代谢途径分析95-97
• 4.4 讨论97-99
• 第五章 倭蜂猴粪便微生物宏基因组文库构建及芳香族化合物代谢基因的研究99-128
• 5.1 引言99-100
• 5.2 实验材料与方法100-106
• 5.2.1 倭蜂猴粪便样品的采集100
• 5.2.2 DNA提取100
• 5.2.3 宏基因组Fosmid文库构建100-104
• 5.2.4 宏基因组Fosmid文库中芳香族化合物代谢相关基因的活性筛选104-105
• 5.2.5 Fosmid质粒提取、验证、测序和分析105
• 5.2.6 苯乙酸代谢基因簇和基因的分析及其系统进化树构建105
• 5.2.7 苯乙酰辅酶A连接酶paaK的生物信息学分析105-106
• 5.2.8 试剂与仪器106
• 5.3 结果与分析106-126
• 5.3.1 倭蜂猴粪便微生物宏基因组DNA提取结果106-107
• 5.3.2 倭蜂猴粪便样品中目的DNA的回收107-109
• 5.3.3 Fosmid宏基因组文库构建109
• 5.3.4 Fosmid宏基因组文库评估109-111
• 5.3.5 Fosmid宏基因组文库中芳香族化合物代谢基因筛选111-112
• 5.3.6 Fosmid质粒测序和分析112-114
• 5.3.7 scaffold11中苯乙酸代谢基因簇的序列分析114-116
• 5.3.8 scaffold3中苯乙酸代谢基因簇的序列分析116-120
• 5.3.9 Brevibacterium sp.苯乙酸代谢基因簇中苯乙酰辅酶A连接酶基因paaK的序列分析及其系统进化研究120-121
• 5.3.10 Brevibacterium sp.苯乙酸代谢基因簇中paaK的一级结构预测121-122
• 5.3.11 Brevibacterium sp.苯乙酸代谢基因簇中paa K的二级结构预测122-124
• 5.3.12 Brevibacterium sp.苯乙酸代谢基因簇中paaK的保守结构域分析和多序列比对124-126
• 5.3.13 Brevibacterium sp.苯乙酸代谢基因簇中paaK的三级结构预测126
• 5.4 讨论126-128
• 第六章 结论与建议128-132
• 6.1 结论与创新点128-129
• 6.1.1 研究结论128-129
• 6.1.2 创新点129
• 6.2 建议与展望129-132
• 参考文献132-153
• 附录153-156
• 攻读学位期间发表的学术论文和研究成果156-158
• 致谢158

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 姚琨;张日俊;;宿主肠道微生物群落多样性和演替分析技术的演变和发展[J];中国微生态学杂志;2006年05期

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本文编号：1007499