微囊藻毒素-LR对鱼类甲状腺激素代谢调控的干扰效应

发布时间：2017-10-20 17:49

  本文关键词：微囊藻毒素-LR对鱼类甲状腺激素代谢调控的干扰效应

  更多相关文章： 微囊藻毒素-LR 肝细胞 甲状腺激素 组织学 基因表达 脱碘酶 鱼类

【摘要】：随着人类社会的发展,大量生活污水以及在农业上施用的化肥等营养物质不断排入江河湖泊等水体,造成了水体的富营养化问题日益严重,并引发蓝藻水华爆发,这已经成为国内外普遍关注的环境问题。而蓝藻水华爆发的一个潜在危害就是能够产生多种类型的藻毒素。微囊藻毒素(MCs)在众多类型的蓝藻毒素中是最常见的一类,而且研究表明又以LR型微囊藻毒素(MC-LR)的毒性最大,分布最广,危害也最为严重。鱼类很容易通过摄食或者鳃的呼吸作用而吸收水中的微囊藻毒素。MC-LR是一种肝毒素,它主要富集于肝脏,并造成严重的肝损伤。另外研究还发现MC-LR还可以造成鱼类肾脏、性腺等组织器官的病变,对鱼类的生长以及发育的过程产生不利的影响,而且还能给机体造成严重的氧化损伤。近年来,研究还发现MC能改变鱼类血浆中甲状腺激素(TH)的水平,提示MC可能对鱼类的甲状腺内分泌系统造成了干扰。尽管MCs影响了鱼类TH代谢的正常生理过程,但TH水平发生变化的具体机制还不清楚。为了深入研究MC对鱼类甲状腺激素代谢调控过程的干扰效应,我们以草鱼离体肝细胞(L8824)以及斑马鱼幼鱼和成鱼为实验材料,首先研究了MC-LR暴露对L8824细胞中I型脱碘酶基因(id1)、II型脱碘酶基因(id2)和III型脱碘酶基因(id3)m RNA的表达水平和相应脱碘酶的活性所造成的影响,然后从体外细胞毒理学实验延伸至斑马鱼的暴露实验,从幼鱼到成鱼,从96 h急性暴露到28 d亚急性暴露开展了相关的研究。研究内容包括鱼类肝脏细胞的培养及活性的测定,甲状腺激素含量的测定,甲状腺滤泡上皮细胞形态结构的切片观察,甲状腺内分泌系统相关基因表达的测定以及脱碘酶活性的测定等方面;通过分析多个暴露时间点来确定体内各项检测指标的动态变化过程,从而进一步阐明MC-LR暴露造成的鱼类甲状腺内分泌系统的干扰效应及其机制。主要研究结果如下:1.L8824细胞在用浓度为1μg/L-1000μg/L的MC-LR分别暴露24 h和48h后,用MTT法所检测的细胞的活性没有发生显著性的变化;id1基因的表达水平在浓度为100μg/L和1000μg/L的MC-LR暴露组中发生了显著性的下降,而id2基因的表达水平则在所有浓度的MC-LR暴露组中均发生了显著性的下降,而id3 基因的表达则发生显著性的上升;另外,MC-LR暴露同样也造成了L8824细胞中ID1和ID2活性的下降以及ID3活性的上升。可见,MC-LR暴露显著改变了L8824细胞中脱碘酶基因的表达及其酶的活性,且ID2对于MC-LR的毒性暴露更为敏感。由于脱碘酶在TH的转化与代谢过程中起到了关键的作用,因此,MC-LR暴露所导致的IDs活性的变化能对TH的正常代谢过程造成潜在的干扰。2.浓度为50μg/L-400μg/L的急性MC-LR暴露均造成了斑马鱼幼鱼体内T4和T3水平的显著降低;其促肾上腺素释放激素(crh)、促甲状腺素(tsh),甲状腺过氧化物酶(tpo)和转运蛋白(ttr)这些与TH合成有关基因的表达水平在MC-LR暴露后均呈现出首先显著性的降低而后升高的表达趋势;甲状腺激素受体(tr-α和tr-β)基因的表达水平在暴露期间则一直呈现显著降低的状态;另外,斑马鱼幼鱼体内ID1和ID2的活性同样随着MC-LR的暴露呈现先降低后升高的趋势,而ID3的活性则在MC-LR暴露期间一直呈现显著降低的现象。实验结果说明急性MC-LR暴露可以显著干扰斑马鱼幼鱼体内涉及TH合成、转运与代谢一系列基因的表达水平,从而对幼鱼体内的甲状腺内分泌系统的正常功能造成了影响,导致体内T4和T3的水平发生了显著的下降,另外,MC-LR对脱碘酶活性的影响也是造成T3水平下降的重要原因。3.急性MC-LR暴露没有造成雄性成鱼中T4的水平发生显著变化,但100μg/L,200μg/L,特别是400μg/L的MC-LR则造成了雌性成鱼体内T4水平的显著下降,但在暴露96 h后,雌性成鱼所有MC-LR暴露组中的T4含量均恢复到了对照组水平;而浓度为100μg/L、200μg/L和400μg/L的急性MC-LR暴露均可以造成雄性成鱼和雌性成鱼体内的T3含量的显著降低;而且MC-LR暴露也造成了脑中和肝脏中涉及TH合成与代谢一系列基因表达水平的改变和肝脏中脱碘酶活性的变化,且随着暴露时间的延长呈现降低或升高的动态波动。说明急性MC-LR暴露同样也对斑马鱼成鱼体内涉及到TH合成,转化与代谢相关的一系列基因的表达和脱碘酶的活性产生了显著的影响,并随着暴露时间的延长呈现出了明显的负反馈调节效应;由于成鱼体内各组织器官系统已经发育完善,对MC-LR的毒性效应能在一定的时间和程度范围内比幼鱼做出更为有效的自我调节,因此,最终体现在TH水平上,急性MC-LR暴露对斑马鱼成鱼造成的干扰效应不如对幼鱼的干扰效应那么显著。4.在浓度为1μg/L、5μg/L和25μg/L的MC-LR暴露组中暴露21 d后,斑马鱼幼鱼体内的T4水平发生了显著的升高,但在暴露的第28 d时,T4水平在所有浓度的MC-LR暴露组中又恢复到了对照组水平。而浓度为5μg/L和25μg/L的MC-LR,特别是25μg/L的MC-LR却造成了斑马鱼幼鱼体内T3水平发生显著性的降低。同时观察到了甲状腺滤泡上皮细胞在1μg/L的MC-LR暴露组暴露28 d后发生了显著的肥大现象,而5μg/L和25μg/L的MC-LR则能造成甲状腺滤泡上皮细胞产生显著的肥大和增生。而crh、tsh、tpo和ttr基因的表达水平在MC-LR暴露后均发生了显著性上升。另外,浓度为5μg/L和25μg/L的MC-LR暴露还造成了斑马鱼幼鱼体内ID1和ID2活性的显著降低,而所有浓度的MC-LR均可以造成ID3活性的显著升高。因此,环境相关浓度的MC-LR对脱碘酶活性所造成的影响能引起T3水平的显著下降,导致甲状腺功能的减退;由于T3含量的下降,刺激下丘脑和垂体产生负反馈调节,从而造成了与TH合成有关的一系列基因表达的上调,而tsh基因表达水平的显著升高可能引起体内Tsh含量的增加,造成对斑马鱼幼鱼体内甲状腺滤泡上皮细胞的过度刺激,导致其产生肥大和增生的现象,并且进一步造成体内T4含量的显著性上升。5.亚急性MC-LR暴露没有造成斑马鱼雄性成鱼或雌性成鱼体内T4水平的显著改变,也没有对雄鱼和雌鱼甲状腺滤泡上皮细胞的形态结构造成显著影响;但在雄性成鱼中,其体内T3的水平在浓度为5μg/L和25μg/L的MC-LR暴露组中暴露21 d后发生了显著性的下降,而1μg/L、5μg/L和25μg/L的MC-LR均能造成FT3的水平发生显著下降。同时也观察到了所有浓度的MC-LR均能造成ID2活性的显著下降;随着暴露时间的延长,体内ID1和ID2的活性分别在第21 d和28 d时发生了显著性的上升,并且T3含量也逐渐恢复到了对照组的水平。另外,虽然MC-LR暴露期间成鱼体内TH的水平没有像幼鱼一样发生显著的改变,但亚急性MC-LR暴露也对TH合成与代谢的一系列基因的表达水平造成了显著的干扰,首先是呈现显著性的下降,但在暴露期间也发生了反馈性的上调现象。因此,环境相关浓度的亚急性MC-LR暴露也对斑马鱼成鱼甲状腺内分泌系统造成了一定的影响,但成鱼有能力在一定的暴露时间内进行有效的调节,来维持体内TH的稳态。
【关键词】：微囊藻毒素-LR 肝细胞 甲状腺激素 组织学 基因表达 脱碘酶 鱼类
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4
【目录】：

• 摘要9-12
• Abstract12-16
• 缩略语表16-17
• 第一章 文献综述17-35
• 1.1 微囊藻毒素概论17-22
• 1.1.1 微囊藻毒素的产生、结构及性质17-19
• 1.1.2 微囊藻毒素在自然水体中的含量19
• 1.1.3 微囊藻毒素的毒性效应19-21
• 1.1.4 微囊藻毒素的致毒机制21-22
• 1.2 鱼类的甲状腺内分泌系统22-29
• 1.2.1 鱼类的甲状腺22
• 1.2.2 鱼类甲状腺激素的合成、转化和代谢22-24
• 1.2.3 甲状腺激素代谢过程中脱碘酶的功能和作用24-26
• 1.2.4 环境污染物对鱼类甲状腺内分泌系统的影响26-29
• 1.3 微囊藻毒素对鱼类的影响29-31
• 1.4 微囊藻毒素对鱼类甲状腺内分泌系统的影响31-32
• 1.5 本论文的研究目的、意义和研究内容32-35
• 1.5.1 研究目的和意义32-33
• 1.5.2 研究内容33-35
• 第二章 微囊藻毒素-LR对草鱼离体肝细胞（L8824）毒性的研究35-53
• 2.1 前言35-36
• 2.2 材料与方法36-47
• 2.2.1 主要试剂36-38
• 2.2.2 L8824 细胞的复苏与传代培养38
• 2.2.3 MC-LR对L8824 细胞的急性毒性暴露38-39
• 2.2.4 MTT法检测L8824 细胞的活性39
• 2.2.5 L8824 细胞RNA的提取及反转录39-41
• 2.2.6 草鱼脱碘酶基因核心片段的克隆41-44
• 2.2.6.1 引物设计及合成41-42
• 2.2.6.2 PCR反应体系及条件42-43
• 2.2.6.3 PCR产物的回收、连接和转化43-44
• 2.2.7 L8824 细胞脱碘酶基因表达的测定44-46
• 2.2.7.1 引物设计44-45
• 2.2.7.2 荧光定量PCR反应体系及条件45-46
• 2.2.8 L8824 细胞脱碘酶活性的测定46-47
• 2.2.8.1 L8824 细胞匀浆液的制备46
• 2.2.8.2 L8824 细胞匀浆液蛋白含量的测定46
• 2.2.8.3 L8824 细胞匀浆液脱碘酶活性的测定46-47
• 2.2.9 数据统计分析47
• 2.3 结果47-51
• 2.3.1 MC-LR对L8824 细胞活性的影响47-48
• 2.3.2 MC-LR对L8824 细胞中脱碘酶基因表达的影响48
• 2.3.3 MC-LR对L8824 细胞中脱碘酶活性的影响48-51
• 2.4 讨论51-52
• 小结52-53
• 第三章 微囊藻毒素-LR对斑马鱼甲状腺激素代谢的急性毒性效应53-84
• 3.1 前言53-54
• 3.2 材料与方法54-61
• 3.2.1 主要试剂54-55
• 3.2.2 斑马鱼的急性毒性暴露55-57
• 3.2.2.1 斑马鱼的饲养及暴露的条件55-56
• 3.2.2.2 暴露水体中MC-LR含量的测定56-57
• 3.2.3 斑马鱼甲状腺激素含量的测定57-58
• 3.2.3.1 全鱼组织匀浆中蛋白含量的测定57
• 3.2.3.2 全鱼组织匀浆中甲状腺激素含量的测定57-58
• 3.2.4 斑马鱼甲状腺系统相关基因表达的测定58-60
• 3.2.4.1 引物设计58-59
• 3.2.4.2 RNA的提取及反转录59
• 3.2.4.3 荧光定量PCR反应体系及条件59-60
• 3.2.5 斑马鱼脱碘酶活性的测定60
• 3.2.5.1 斑马鱼组织匀浆液的制备60
• 3.2.5.2 斑马鱼组织匀浆液蛋白含量的测定60
• 3.2.5.3 斑马鱼组织匀浆液脱碘酶活性的测定60
• 3.2.6 数据统计分析60-61
• 3.3 结果61-75
• 3.3.1 急性MC-LR暴露对斑马鱼幼鱼甲状腺激素代谢的影响61-65
• 3.3.1.1 MC-LR对斑马鱼幼鱼T4和T3水平的影响61-62
• 3.3.1.2 MC-LR对斑马鱼幼鱼甲状腺相关基因表达的影响62-63
• 3.3.1.3 MC-LR对斑马鱼幼鱼脱碘酶活性的影响63-65
• 3.3.2 急性MC-LR暴露对斑马鱼雄性成鱼甲状腺激素代谢的影响65-68
• 3.3.2.1 MC-LR对斑马鱼雄性成鱼T4和T3水平的影响65-66
• 3.3.2.2 MC-LR对斑马鱼雄性成鱼甲状腺相关基因表达的影响66-67
• 3.3.2.3 MC-LR对斑马鱼雄性成鱼脱碘酶活性的影响67-68
• 3.3.3 急性MC-LR暴露对斑马鱼雌性成鱼甲状腺激素代谢的影响68-75
• 3.3.3.1 MC-LR对斑马鱼雌性成鱼T4和T3水平的影响68
• 3.3.3.2 MC-LR对斑马鱼雌性成鱼甲状腺相关基因表达的影响68-71
• 3.3.3.3 MC-LR对斑马鱼雌性成鱼脱碘酶活性的影响71-75
• 3.4 讨论75-84
• 3.4.1 急性MC-LR暴露对斑马鱼幼鱼甲状腺激素代谢的影响75-78
• 小结78
• 3.4.2 急性MC-LR暴露对斑马鱼成鱼甲状腺激素代谢的影响78-84
• 3.4.2.1 急性MC-LR暴露对斑马鱼雄性成鱼甲状腺激素代谢的影响79-81
• 3.4.2.2 急性MC-LR暴露对斑马鱼雌性成鱼甲状腺激素代谢的影响81-82
• 小结82-84
• 第四章 微囊藻毒素-LR对斑马鱼甲状腺激素代谢的亚急性毒性效应84-122
• 4.1 前言84-86
• 4.2 材料与方法86-92
• 4.2.1 主要试剂86
• 4.2.2 斑马鱼的亚急性毒性暴露86-87
• 4.2.2.1 斑马鱼的饲养及暴露的条件86-87
• 4.2.2.2 暴露水体中MC-LR含量的测定87
• 4.2.3 斑马鱼甲状腺激素含量的测定87-88
• 4.2.3.1 全鱼组织匀浆中蛋白含量的测定87
• 4.2.3.2 全鱼组织匀浆中甲状腺激素含量的测定87-88
• 4.2.4 斑马鱼甲状腺组织结构切片的观察88-90
• 4.2.4.1 斑马鱼甲状腺组织的脱钙88
• 4.2.4.2 斑马鱼甲状腺组织的包埋88-89
• 4.2.4.3 斑马鱼甲状腺组织的切片89
• 4.2.4.4 斑马鱼甲状腺组织切片的染色89-90
• 4.2.5 斑马鱼甲状腺系统相关基因表达的测定90-91
• 4.2.5.1 引物设计90
• 4.2.5.2 RNA的提取及反转录90-91
• 4.2.5.3 荧光定量PCR反应体系及条件91
• 4.2.6 斑马鱼脱碘酶活性的测定91
• 4.2.6.1 斑马鱼组织匀浆液的制备91
• 4.2.6.2 斑马鱼组织匀浆液蛋白含量的测定91
• 4.2.6.3 斑马鱼组织匀浆液脱碘酶活性的测定91
• 4.2.7 数据统计分析91-92
• 4.3 结果92-114
• 4.3.1 亚急性MC-LR暴露对斑马鱼幼鱼甲状腺激素代谢的影响92-100
• 4.3.1.1 MC-LR对斑马鱼幼鱼甲状腺激素水平的影响92
• 4.3.1.2 MC-LR对斑马鱼幼鱼甲状腺组织结构的影响92-96
• 4.3.1.3 MC-LR对斑马鱼幼鱼甲状腺相关基因表达的影响96-97
• 4.3.1.4 MC-LR对斑马鱼幼鱼脱碘酶活性的影响97-100
• 4.3.2 亚急性MC-LR暴露对斑马鱼雄性成鱼甲状腺激素代谢的影响100-107
• 4.3.2.1 MC-LR对斑马鱼雄性成鱼甲状腺激素水平的影响100
• 4.3.2.2 MC-LR对斑马鱼雄性成鱼甲状腺组织结构的影响100
• 4.3.2.3 MC-LR对斑马鱼雄性成鱼甲状腺相关基因表达的影响100-104
• 4.3.2.4 MC-LR对斑马鱼雄性成鱼脱碘酶活性的影响104-107
• 4.3.3 亚急性MC-LR暴露对斑马鱼雌性成鱼甲状腺激素代谢的影响107-114
• 4.3.3.1 MC-LR对斑马鱼雌性成鱼甲状腺激素水平的影响107
• 4.3.3.2 MC-LR对斑马鱼雌性成鱼甲状腺组织结构的影响107
• 4.3.3.3 MC-LR对斑马鱼雌性成鱼甲状腺相关基因表达的影响107-111
• 4.3.3.4 MC-LR对斑马鱼雌性成鱼脱碘酶活性的影响111-114
• 4.4 讨论114-122
• 4.4.1 亚急性MC-LR暴露对斑马鱼幼鱼甲状腺激素代谢的影响114-117
• 小结117
• 4.4.2 亚急性MC-LR暴露对斑马鱼成鱼甲状腺激素代谢的影响117-122
• 4.4.2.1 MC-LR暴露对斑马鱼雄性成鱼甲状腺激素代谢的影响118-119
• 4.4.2.2 MC-LR暴露对斑马鱼雌性成鱼甲状腺激素代谢的影响119-121
• 小结121-122
• 第五章 全文小结及展望122-125
• 5.1 全文小结122-123
• 5.2 展望123-125
• 参考文献125-144
• 发表论文及专利情况144-145
• 致谢145-147

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 张春景;陆开宏;朱津永;梁晶晶;;微囊藻毒素对鱼类组织器官的毒理学研究进展[J];水产科学;2009年09期

2 原居林;叶金云;沈锦玉;尹文林;胡廷尖;张爱菊;;微囊藻毒素对太湖翘嘴红湆早期发育阶段的毒性研究[J];水产科学;2010年06期

3 瞿t熺，

本文编号：1068534