基于两亲性抗菌肽Melittin在脂质体表面形成孔洞机理的动态过程研究

发布时间：2017-10-21 06:37

  本文关键词：基于两亲性抗菌肽Melittin在脂质体表面形成孔洞机理的动态过程研究

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【摘要】：目前抗生素的大量使用甚至滥用导致抗药性的现象日益严重,抗菌肽因为具有杀菌作用又不易产生抗药性而备受关注。这主要因为其作用靶标为生物膜,这种独特的抗菌机理使其成为抗菌甚者抗肿瘤领域的研究热点。对于抗菌肽与模拟生物膜之间相互作用机理的研究报道很多,其中也有不少是关于两亲性的抗菌肽在脂质体表面形成孔洞的理论研究,但是对孔洞形成机理的动力学方面,尤其在实验条件下关于这一动态过程的检测与验证研究并未见报道。 本论文的研究重点是以二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phophocholine, DMPC)制备的脂质体(Liposome)作为细胞膜的模型,通过调控反应温度,抗菌肽(Melittin)的浓度,脂质体的直径以及包埋在脂质体里面的荧光染料的尺寸等条件,来研究Melittin在DMPC脂质体表面形成孔洞机理的动态过程。 本论文首次在实验条件下测得Melittin与DMPC脂质体作用过程中,释放染料分子前形成孔洞所需要的时间(Lag-time)及形成孔洞时Melittin的阈值浓度。通过改变实验条件的温度,定量研究Lag-time与Melittin在脂质体单位表面积的个数Q(N/nm2)之间的定量关系。荧光实验结果表明孔洞形成的过程是Melittin首先在脂质体表面形成一个临界孔洞,随着时间的延长,孔洞直径不断扩大,直到可以释放染料分子的尺寸,并且孔洞直径扩大的速率在一定范围内与Melittin的浓度有关。 在荧光实验的基础上,通过圆二色谱(CD)实验,根据Melittin二级结构α-螺旋结构的百分含量变化来研究孔洞形成过程。CD实验结果表明在实验条件下发现Melittin在脂质体悬浮液中可以形成α-螺旋的二级结构。Melittin的浓度一定时,具有α-螺旋二级结构的Melittin分子的百分含量随脂质体浓度升高而增加；但是在实验条件下未发现Melittin的α-螺旋结构的百分含量与反应时间的相关性；又通过改变实验条件下的温度,发现α-螺旋的百分含量随温度的降低而减少,在一定程度上解释了荧光实验中低温下可以测得Lag-time,而在温度升高时难以测得Lag-time。 本论文还设计了利用共聚焦激光扫描显微镜(Confocal laser scanning microscope,CLSM)定点扫描的方法,首次采用“微分区域法”处理成像结果,将拍摄中得到的脂质体图像在平面上微分成n(8)个圆心在同一水平直线上,半径为r(100nm)的小圆区域。通过在平面上,将直线及上面的小圆区域绕垂直与平面并过脂质体圆心O的直线旋转一周,测得该直线旋转过不同角度θ时的,每个小圆区域内荧光强度,通过绘制荧光强度随时间变化的曲线,以研究在这一过程中脂质体内荧光物质的运动规律。通过比较每个小圆区域内荧光强度变化规律,证明应用“微分区域法”测量绘制的荧光强度随区域的变化及分布图,可以确定脂质体内荧光染料的流动方向,证明在脂质体表面一定范围的位置形成孔洞,导致脂质体内的染料分子流出脂质体。 本文还推导了体系的自由能变化,构建了Lag-time的计算模型,讨论了抗菌肽在脂质体表面形成孔洞的动态过程,并且通过理论计算与实验数据的基本吻合,证明了模型的可适用性。
【关键词】：杀菌机理 抗菌肽 延迟时间 跨膜孔洞 脂质体
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TQ450.2
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-7
• 第一章 绪论7-25
• 1.1 国内外研究现状8-22
• 1.1.1 抗菌肽的发现及意义8-9
• 1.1.2 抗菌肽的功能与结构9-15
• 1.1.3 脂质体囊泡模拟生物膜15-16
• 1.1.4 抗菌肽抗菌机理模型的研究展16-22
• 1.2 本研究的意义及内容22-25
• 1.2.1 研究的意义22-23
• 1.2.2 研究的内容23-25
• 第二章 脂质体的制备与表征25-40
• 2.1 优化脂质体制备的条件25-33
• 2.1.1 实验材料与仪器26
• 2.1.2 缓冲溶液制备26
• 2.1.3 DMPC空白脂质体(LWD)制备26-28
• 2.1.4 制备装载荧光染料的脂质体28-29
• 2.1.5 实验结果与分析29-33
• 2.2 脂质体尺寸的表征33-37
• 2.2.1 实验材料与仪器33
• 2.2.2 脂质体尺寸的测量方法33-34
• 2.2.3 实验结果与分析34-37
• 2.3 测量脂质体Zeta电位37-39
• 2.3.1 实验材料与仪器37-38
• 2.3.2 脂质体Zeta电位的测量方法38
• 2.3.3 实验结果与分析38-39
• 2.4 小结39-40
• 第三章 Melittin与脂质体作用过程的时间效应研究40-56
• 3.1 实验材料与方法40-41
• 3.1.1 实验材料与仪器40-41
• 3.1.2 荧光实验参数优化41
• 3.1.3 Melittin与脂质体25℃时的荧光实验41
• 3.2 实验结果与分析41-55
• 3.2.1 确定荧光实验参数41-44
• 3.2.2 25℃时Melittin与脂质体相互作用的动力学研究44-48
• 3.2.3 18℃时Melittin与脂质体相互作用的动力学研究48-52
• 3.2.4 形成的孔洞直径随时间的变化规律52-55
• 3.3 小结55-56
• 第四章 Melittin与脂质体相互作用时二级结构的变化规律56-67
• 4.1 实验材料与方法56-57
• 4.1.1 实验材料56-57
• 4.1.2 实验仪器和软件57
• 4.2 实验结果与分析57-66
• 4.2.1 介质对Melittin二级结构的影响57-64
• 4.2.2 温度对体系中Melittin二级结构的影响64-66
• 4.3 小结66-67
• 第五章 应用CLSM技术研究Melittin与脂质体相互作用时孔洞的形成67-78
• 5.1 实验材料与方法67-69
• 5.1.1 包埋钙黄绿素的脂质体的制备67
• 5.1.2 Melittin溶液的准备67
• 5.1.3 CLSM实验方法67-68
• 5.1.4 CLSM实验数据处理方法68-69
• 5.2 实验结果与分析69-77
• 5.2.1 Melittin对体系荧光淬灭的影响69-71
• 5.2.2 Melittin与脂质体相互作用时孔洞形成位置的研究71-77
• 5.3 小结77-78
• 第六章 模型构建初探78-88
• 6.1 孔洞形成的自由能79-80
• 6.2 多肽聚集的自由能80
• 6.3 静电自由能80-82
• 6.4 亲水头弯曲产生的自由能82-87
• 6.5 小结87-88
• 第七章 结论88-89
• 参考文献89-99
• 本论文中的~.略词99-100
• 附录100-110
• 致谢110-111
• 个人简历111

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

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3 刘先凯,赵彤言;昆虫抗菌肽研究进展[J];寄生虫与医学昆虫学报;2001年02期

4 廖乾生,林福呈,李德葆;植物防御素及其研究进展[J];浙江大学学报(农业与生命科学版);2003年01期

本文编号：1071843