中华绒螯蟹组蛋白基因的克隆及其在精子发生中的变化特征

发布时间：2017-10-22 19:21

  本文关键词：中华绒螯蟹组蛋白基因的克隆及其在精子发生中的变化特征

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【摘要】：在大多数动物的精子发生过程中,与DNA结合的碱性蛋白会逐渐发生变化,体细胞的组蛋白会被一种过渡蛋白替代,随后被碱性更强的鱼精蛋白替代,随着替代的蛋白碱性越来越强,精子核被一步步浓缩成了致密的结构。中华绒螯蟹,又称毛蟹、河蟹,在分类地位上隶属于节肢动物门、甲壳纲、十足目、方蟹科、绒螯蟹属。此类动物的精子无鞭毛,由一个呈酒杯状的细胞核包裹着一个球形的顶体构成。一个有趣的现象是此类动物的精子核缺少致密的染色质,其精子为非浓缩核,但是其形成机制尚不是很清楚。为了研究组蛋白在中华绒螯蟹精子发生中的变化特征,本文首先通过PCR的方法克隆出四种组蛋白H2A、H2B、H3和H4的编码区基因,其中H2B的编码区长369 bp,编码123个氨基酸,预测分子量大小为13.6 Ku,H2A的编码区包含369 bp的碱基,编码123个氨基酸,预测分子量为13.1 Ku,H3的编码区包含408 bp的碱基,编码136个氨基酸,预测分子量为15.3 Ku,H4的编码区为309 bp,编码103个氨基酸,预测分子量为11.3 ku。随后构建了相应的原核表达载体p ET-30a-H2B、p ET-30a-H2A、p ET-30a-H3和p ET-30a-H4,之后分别转化大肠杆(Escherichia coli)Rosetta(DE3)感受态细胞中,经过异丙基β-D硫代半乳糖苷酶(IPTG)诱导成功表达出相应的重组蛋白;利用NIA-琼脂糖凝胶柱来纯化重组蛋白,免疫新西兰大白兔(Oryctolagus cuniculus),制备了H2A和H2B的多克隆抗体。其次,通过免疫荧光和免疫电镜技术来检测四种组蛋白H2B、H2A、H3和H4在中华绒螯蟹精子发生中的变化,得到以下实验结果:1.组蛋白H2B在精原细胞、精母细胞、早期精细胞及其变态中期精细胞的核内一直存在,在精细胞变态晚期,组蛋白H2B有一部分从细胞核转移到了顶体囊中。在成熟的精子中,组蛋白H2B主要存在于顶体囊中。2.组蛋白H3在中华绒螯蟹的整个精子发生过程中一直存在于生殖细胞包括成熟精子的核内,并没有发生抛弃和转移。3.组蛋白H4在精原细胞、精母细胞、精细胞及其变态中的精细胞和成熟的精子的核内一直存在,没有发生向核外或者顶体囊的转移。4.组蛋白H2A在精原细胞、精母细胞、精细胞的细胞核和细胞质中存在,在成熟的精子中,主要存在于顶体囊和核杯内侧。通过以上的实验结果,我们推测中华绒螯蟹成熟精子核内组蛋白H3和H4的保留以及精子形成过程中H2B和H2A向顶体囊的转移与其非浓缩核有一定的关系。
【关键词】：中华绒螯蟹 精子发生 组蛋白 基因克隆 免疫荧光 免疫电镜 非浓缩核
【学位授予单位】：河北大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4
【目录】：

• 摘要5-7
• 英文摘要7-13
• 第1章 绪论13-24
• 1.1 精子发生及与其相关的核碱性蛋白13-18
• 1.1.1 精子发生13-14
• 1.1.2 十足目甲壳动物的精子发生14
• 1.1.3 精子核碱性蛋白及其在精子发生中的替代14-18
• 1.1.4 精子核碱性蛋白的修饰在精子核形成中的作用18
• 1.2 十足目非浓缩核的精子核及其碱性蛋白18-20
• 1.3 中华绒螯蟹的雄性生殖系统20-23
• 1.4 研究目的及意义23-24
• 第2章 实验材料和方法24-37
• 2.1 实验材料24
• 2.2 主要实验仪器24-25
• 2.3 主要实验药品及配方25-28
• 2.4 试验技术28-37
• 2.4.1 RNA提取及反转录反应28-29
• 2.4.2 基因组DNA的提取29
• 2.4.3 RNA的反转录29-30
• 2.4.4 常规PCR反应30
• 2.4.5 目的片段的回收30-31
• 2.4.6 TA克隆及测序31
• 2.4.7菌种的保存31
• 2.4.8 质粒的提取31-32
• 2.4.9 目的基因与表达载体p ET-30a的连接32
• 2.4.10目的基因的表达32
• 2.4.11镍柱纯化融合蛋白32-33
• 2.4.12多克隆抗体的制备33
• 2.4.13 Western blot检测抗体33-34
• 2.4.14石蜡切片34
• 2.4.15免疫荧光34-35
• 2.4.16免疫电镜35-37
• 第3章 中华绒螯蟹组蛋白H2B、H2A、H3和H4的基因克隆、原核表达及抗体制备2537-74
• 3.1 组蛋白H2B的基因克隆，，原核表达及抗体制备37-46
• 3.1.1 方法与步骤37-38
• 3.1.2 实验结果38-46
• 3.2 组蛋白H2A的基因克隆，原核表达及抗体制备46-54
• 3.2.1 方法与步骤46-47
• 3.2.2 实验结果47-54
• 3.3 组蛋白H3的基因克隆及原核表达54-61
• 3.3.1 方法与步骤54-55
• 3.3.2 实验结果55-61
• 3.4 组蛋白H4的基因的克隆及原核表达61-68
• 3.4.1 方法与步骤61-62
• 3.4.2 实验结果62-68
• 3.5 讨论68-74
• 3.5.1 组蛋白基因的克隆68-69
• 3.5.2 原核表达载体的构建69-71
• 3.5.3 重组蛋白的表达71
• 3.5.4 重组蛋白的纯化71-72
• 3.5.5 多克隆抗体的制备72
• 3.5.6 Western blot分析72-74
• 第4章 中华绒螯蟹四种组蛋白H2B、H2A、H3和H4在精子发生中的变化74-97
• 4.1 精巢的组织切片74-78
• 4.1.1 方法与步骤74
• 4.1.2 实验结果74-78
• 4.2 组蛋白H3和H4在精子发生中的变化特征78-89
• 4.2.1 方法与步骤78
• 4.2.2 实验结果78-89
• 4.3 组蛋白H2B在精子发生中的变化特征89-91
• 4.3.1 方法与步骤89
• 4.3.2 实验结果89-91
• 4.4 组蛋白H2A在精子发生中的变化特征91-93
• 4.4.1 方法与步骤91
• 4.4.2 实验结果91-93
• 4.5 讨论93-97
• 4.5.1 碱性蛋白在十足目动物精子发生中的变化特征93-94
• 4.5.2 中华绒螯蟹精子非浓缩核的初步分析94-96
• 4.5.3 存在问题和展望96-97
• 结论97-98
• 参考文献98-110
• 致谢110-111
• 攻读博士期间取得的科研成果111-11

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