毛白杨钙离子依赖的核酸酶PtCDD基因在次生木质部发育中的功能研究

发布时间：2017-10-24 14:20

  本文关键词：毛白杨钙离子依赖的核酸酶PtCDD基因在次生木质部发育中的功能研究

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【摘要】：木材发育是植物发育生物学领域研究的前沿热点,具有典型的细胞程序化死亡的特征。其发育过程包括维管形成层细胞启动分化,细胞的迅速扩张,次生细胞壁的沉积,最后细胞死亡四个过程。核酸酶在木质部细胞死亡的最后阶段发挥至关重要的作用。近期的研究表明SNc结构域基因家族中核酸酶基因参与了单性花的塑造和杜仲次生木质部发育,但在杨树茎的次生木质部发育中尚未发现该类型基因。因此,研究次生木质部核酸酶基因的功能对于揭示次生木质部发育的机理具有重要意义。本论文着重研究了毛白杨次生木质部发育中Pt CDD基因的重要作用,研究结果为理解毛白杨木材发育的分子机理提供了重要信息。主要研究结果如下:Pt CDD基因序列分析表明属于典型的SNc结构域基因家族。RT-PCR结果表明,Pt CDD基因在杨树根、茎、叶、雄花序、雌花序和花粉等组织中均有表达。进一步检测表明Pt CDD基因在茎中主要是在韧皮部,形成层和未成熟木质部表达。Pt CDD启动子融合GUS报告基因转化84K杨后,通过GUS染色分析发现,GUS主要在杨树维管组织中特异表达,尤其在韧皮部,形成层和未成熟木质部中检测到特异的GUS信号。Pt CDD基因的表达模式表明Pt CDD基因可能参与了杨树维管组织的发育。通过Pt CDD基因启动子序列分析,发现该基因启动子区域富含激素和环境相关的顺式作用元件。分别通过激素ABA和GA,以及SA、干旱和Na Cl处理PPt CDD::GUS转基因84K叶片,发现GUS的活性受到这些因素的影响。这些结果都说明Pt CDD基因可能受到多种激素和环境的影响而表达。为了研究Pt CDD基因的功能,分别在Pt CDD N端和C端融合绿色荧光蛋白(GFP)进行活体蛋白亚细胞定位观察,结果显示Pt CDD蛋白C端氨基酸序列具有影响该蛋白定位的功能,而GFP-Pt CDD蛋白与核定位RFP-IIP蛋白共定位结果表明,Pt CDD基因的表达产物可以随着时间的延伸而准确的定位于细胞核中。为了研究Pt CDD基因在活体植物组织细胞中的功能,采用农杆菌介导的方法,分别在烟草叶片中瞬时表达Pt CDD基因、Pt CDD基因Ca2+结合位点突变和Pt CDD基因SNc活性位点突变,观察它们对烟草叶片细胞的影响。结果显示,注射烟草叶片3d后检测到基因的表达水平显著升高,两周后表达Pt CDD的位置叶肉细胞发生死亡,而注射对照、Ca2+结合位点突变和SNc结构域突变的位置叶肉细胞未发生死亡。这些结果表明Pt CDD基因是具有Ca2+离子依赖的SNc结构域活性的DNase,可以活体内降解基因组DNA引发细胞死亡。超表达Pt CDD基因的84K杨转基因植株表型分析发现Pt CDD基因活性的增加,影响了分化侧根的能力。茎的切片观察到在第3节间超表达植株导管分化数目要多于野生型对照;第5节间木质部细胞层数和检测的TUNEL信号都显著多于野生型对照;第7和9节间,超表达材料单位面积的导管数目要显著多于野生型对照。这些结果都说明Pt CDD基因能促进杨树导管的分化。通过病毒诱导的基因沉默技术,抑制或降低烟草Pt CDD同源基因的表达,发现病毒诱导后烟草Pt CDD同源基因表达量显著下调,导致植株发育迟缓,未成熟木质部自发荧光较弱,表明Pt CDD同源基因活性下调后,可能会延迟次生壁的沉积和影响次生木质部的发育。本论文通过分析Pt CDD基因的组织特异表达模式、Pt CDD蛋白的亚细胞定位、烟草表达致死实验和促进杨树导管的提前分化等结果,都证明Pt CDD基因在杨树次生木质部发育的细胞程序化死亡过程中起重要作用。通过启动基因组DNA的降解,触发细胞的死亡,最终发育形成成熟的木材。
【关键词】：木材发育 毛白杨 PtCDD基因 细胞程序化死亡 导管分化
【学位授予单位】：中国林业科学研究院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S792.117
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-15
• 第一章 绪论15-58
• 1.1 引言15-41
• 1.1.1 植物细胞程序化死亡的研究进展16-23
• 1.1.2 木质部发育过程中细胞程序化死亡的研究进展23-36
• 1.1.3 DNase基因的研究进展36-41
• 1.2 研究目的和主要的研究内容41-44
• 1.2.1 本论文中关键的科学问题和研究目的41-43
• 1.2.2 本研究中主要的研究内容43-44
• 1.3 本研究的技术路线44-45
• 1.4 材料与方法45-58
• 1.4.1 实验材料45-47
• 1.4.2 实验方法47-58
• 第二章 毛白杨PtCDD基因的表达模式分析58-69
• 2.1 材料方法58
• 2.2 结果与分析58-67
• 2.2.1 PtCDD基因的序列分析58-59
• 2.2.2 PtCDD基因的表达分析59-61
• 2.2.3 启动子PPtCDD::GUS转化植株表达分析61-67
• 2.3 小结67-69
• 第三章 毛白杨PtCDD蛋白的定位与功能鉴定69-76
• 3.1 材料方法69
• 3.2 结果与分析69-74
• 3.2.1 PtCDD蛋白的亚细胞定位69-71
• 3.2.2 烟草叶片瞬时超表达PtCDD诱导细胞死亡71-74
• 3.3 小结74-76
• 第四章 毛白杨PtCDD基因在杨树木质部细胞发育的作用76-88
• 4.1 材料方法76
• 4.2 结果与分析76-86
• 4.2.1 PtCDD超表达植株表达分析76-77
• 4.2.2 35S::PtCDD转基因 84K杨植株表型分析与显微结构观察77-83
• 4.2.3 VIGS技术沉默烟草PtCDD同源基因83-86
• 4.3 小结86-88
• 第五章 结论与讨论88-99
• 5.1 结论88-91
• 5.1.1 PtCDD基因属于典型的SNc结构域基因家族88
• 5.1.2 PtCDD基因启动子活性受环境和激素的影响，，并具有维管组织特异的表达模式88-89
• 5.1.3 PtCDD蛋白具有准确的细胞核定位功能89-90
• 5.1.4 35S::PtCDD转基因 84K杨树引发茎导管提早分化90
• 5.1.5 瞬时超表达PtCDD触发烟草叶肉细胞死亡90-91
• 5.1.6 沉默烟草PtCDD同源基因使茎发育受到影响91
• 5.2 讨论91-97
• 5.2.1 PtCDD基因的表达模式91-92
• 5.2.2 PtCDD蛋白的亚细胞定位92-93
• 5.2.3 烟草叶肉细胞体内超表达PtCDD基因触发细胞死亡93-94
• 5.2.4 PtCDD基因参与茎木质部导管的发育94-97
• 5.3 展望97-99
• 参考文献99-115
• 附录115-118
• 在读期间的学术研究118-119
• 致谢119

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1 王俊刚;毛白杨钙离子依赖的核酸酶PtCDD基因在次生木质部发育中的功能研究[D];中国林业科学研究院;2015年

本文编号：1089136