鱼类淋巴囊肿病毒感染对27.8kDa受体表达及牙鲆鳃转录组表达的影响

发布时间：2017-10-24 16:29

  本文关键词：鱼类淋巴囊肿病毒感染对27.8kDa受体表达及牙鲆鳃转录组表达的影响

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【摘要】：淋巴囊肿病是危害水产养殖业健康发展的重要病毒性疾病之一,已知可感染超过42科140种以上的淡水、半咸水和海水鱼类。淋巴囊肿病毒(lymphocystis disease virus, LCDV)为该病的病原,在我国养殖的牙鲆(Paralichthys olivaceus)、大菱鲆(Scophthalmus maximus)和花鲈(Lateolabrax japonicus)等经济鱼类中流行较为广泛。研究表明LCDV是通过受体介导作用进入宿主细胞。本实验室前期曾在牙鲆鳃细胞系(FG)上鉴定出一个27.8kDa受体蛋白与LCDV感染有关,并制备了抗27.8kDa受体蛋白的单克隆抗体。本文在牙鲆FG细胞和胚胎细胞(HINAE)上分析了LCDV感染与27.8kDa受体蛋白表达的相互关系；研究了该受体蛋白在牙鲆、大菱鲆和花鲈中的组织分布及LCDV感染诱导的动态表达特点；探究了27.8kDa受体蛋白在LCDV感染牙鲆外周血白细胞的作用,研究结果促进了对LCDV侵染机制及传播途径的认识；通过RNA-seq分析了LCDV感染后牙鲆鳃转录组表达变化,为揭示LCDV致病机理提供重要数据。具体研究内容和结果如下：(1)牙鲆FG和HINAE细胞上27.8kDa受体蛋白表达与LCDV感染的相互关系研究。蛋白免疫印迹表明,抗27.8kDa受体蛋白单抗可以特异性地结合FG和HINAE细胞膜蛋白中的一条分子量为27.8kDa的蛋白；病毒受体共荧光染色发现,27.8kDa受体表达于FG和HINAE细胞表面,并与LCDV共定位；病毒感染后,细胞中受体蛋白的表达通过双抗夹心ELISA进行检测,结果发现受体蛋白表达水平与病毒滴度呈正相关；感染9天期间,细胞中受体蛋白表达呈先上升后下降趋势；感染期间,细胞中LCDV载量通过荧光定量PCR进行检测,结果发现,病毒的增殖规律与受体蛋白类似,但是其峰值出现时间比受体蛋白要晚。感染过程各个取样时间点,FG细胞中27.8kDa受体蛋白和LCDV载量都比HINAE细胞高。单抗阻断实验显示,当增加抗27.8kDa受体蛋白单抗浓度,感染后细胞中27.8kDa受体蛋白的上调表达和LCDV增殖会受到明显抑制,体外感染实验中相应的细胞病变也明显减少。这些结果表明,预封闭抗27.8kDa受体蛋白单抗可以抑制感染后细胞受体的表达及病毒增殖。本项研究表明,LCDV感染后可以引发细胞中27.8kDa受体出现上调表达,从而又增加了细胞对于LCDV的易感性。(2)27.8kDa受体蛋白在牙鲆、大菱鲆和花鲈的组织分布及LCDV感染后的表达动态。以抗27.8kDa受体蛋白单抗为检测探针,利用间接免疫荧光和免疫组织化学技术对三种健康鱼的鳃、胃、肠、皮肤、脑、心脏、肝脏、脾脏、头肾、体肾和性腺进行检测,结果表明所检测的组织中都有27.8kDa受体蛋白的阳性信号：利用间接ELISA检测组织中27.8kDa受体蛋白的表达,该受体在健康牙鲆鳃和胃中表达最高,在体肾中表达最低；在大菱鲆中,该受体表达在胃、鳃、心脏和肠中表达相对较高,在卵巢和脑中表达相对较低；在花鲈中,受体表达在鳃和表皮中表达相对较高,在体肾和脑中表达相对较低。病毒感染后,组织中27.8kDa受体蛋白表达呈上调表达。实时荧光定量PCR结果表明,病毒拷贝数随着时间进程而逐渐增多,且较高的LCDV载量一般出现在感染前受体表达量较高的组织。用感染后的血细胞进行间接免疫荧光检测,结果表明,红细胞中没有27.8kDa受体蛋白和LCDV阳性信号,但是某些白细胞亚群中有两者的阳性信号。本研究表明,来源于牙鲆的27.8kDa受体蛋白也在大菱鲆和花鲈感染LCDV中扮演受体蛋白角色,外周血白细胞对病毒的易感性可能导致LCDV在体内的全身感染；LCDV在牙鲆、大菱鲆和花鲈中存在垂直传播的可能。这些数据有助于理解淋巴囊肿致病机理和在鱼类的传播途径。(3)27.8kDa受体蛋白在LCDV感染牙鲆外周血白细胞的意义。本研究通过定位感染病毒后外周血27.8kDa受体蛋白及LCDV的分布来分析LCDV的血液传播。感染3小时后,在牙鲆红细胞中没有检测到27.8kDa受体蛋白和LCDV的阳性信号,但是在部分白细胞中出现了两者的阳性信号。免疫电镜证实,细胞膜表面确实由27.8kDa受体蛋白分布;流式细胞术表明,白细胞中27.8kDa受体蛋白阳性细胞率为14.28%。透射电镜下,对白细胞体外感染LCDV的超薄切片进行观察,结果发现,感染病毒1小时后,病毒吸附于白细胞膜上,而感染36小时后,细胞中LCDV复制则非常充分。多荧光染色实验表明：1)白细胞上27.8kDa受体蛋白和LCDV阳性信号出现共定位于部分白细胞表面；2)CD3阳性细胞与LCDV阳性细胞不交叉；(3)所有的IgM和IgD阳性细胞都对LCDV易感。本研究表明,27.8kDa受体表达于部分白细胞表面,导致这些细胞对LCDV易感,IgM+和IgD+白细胞很可能参与了LCDV的血液传播。(4)牙鲆感染LCDV后鳃组织的转录组学研究。牙鲆感染LCDV一周后,采用RNA测序技术(RNA-seq)分析鳃中的差异表达基因。选取感染和未感染LCDV的鳃组织RNA,通过Illumina HiSeq 2500测序平台进行混合测序。测序后共获得193,225,170个clean reads,拼接组装后得到106,293个unigenes,其中36,537个(34.37%)在公共数据库被成功注释。分析感染前后基因表达水平发现,感染后共有1812个基因出现上调表达,1626个基因发生下调表达,这些差异基因富集于14个Gene Ontology子集和22条信号通路。对这些差异基因进行功能分析发现,它们参与了炎症反应、泛素-蛋白酶体通路、细胞增殖、细胞凋亡、肿瘤形成及抗病毒感染。实时荧光定量PCR结果表明,RNA-seq结果准确可靠。本项研究数据不仅有助于鉴定与发现牙鲆新基因,并首次对于LCDV感染早期的转录组学应答进行了分析。
【关键词】：淋巴囊肿病毒 27.8kDa受体 受体表达动态 病毒传播途径 转录组学 病毒致病机理
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S943
【目录】：

• 摘要5-8
• Abshacrt8-16
• 1. 前言16-32
• 1.1 牙鲆淋巴囊肿病毒的研究进展16-20
• 1.1.1 鱼类淋巴囊肿病流行规律概述16
• 1.1.2 LCD的病理学研究16-17
• 1.1.3 鱼体对LCDV感染的免疫应答17
• 1.1.4 LCDV分子结构17
• 1.1.5 LCDV传播途径研究17-18
• 1.1.6 LCDV的体外培养方法18
• 1.1.7 LCD的诊断学研究18-19
• 1.1.8 LCD的防治方法19-20
• 1.2 动物病毒受体研究方法概述20-27
• 1.2.1 病毒受体的生物学特性20
• 1.2.2 病毒受体研究方法20-25
• 1.2.3 水生动物病毒受体的研究进展25-26
• 1.2.4 27.8kDa受体蛋白的研究进展26-27
• 1.3 转录组学在动物病毒性疾病研究中的应用27-31
• 1.3.1 转录组学介绍27
• 1.3.2 转录组学研究常用技术介绍27-29
• 1.3.3 转录组学技术在动物病毒性疾病研究中的应用29-31
• 1.4 本论文的研究目的及意义31-32
• 2. 牙鲆FG和HINAE细胞上27.8 kDa受体蛋白表达与LCDV感染的动态关系32-54
• 2.1 牙鲆鳃细胞和胚胎细胞培养及LCDV提纯32-38
• 2.1.1 实验材料与试剂32-33
• 2.1.2 方法33-34
• 2.1.3 结果34-37
• 2.1.4 讨论37-38
• 2.2 牙鲆27.8kDa受体蛋白与LCDV相互作用关系研究38-52
• 2.2.1 材料与仪器38
• 2.2.2 实验方法38-43
• 2.2.3 结果43-52
• 2.2.4 讨论52
• 本椝小结52-54
• 3. 27.8kDa受体蛋白在牙鲆、大菱鲆和花鲈的组织分布及LCDV感染后的表达动态研究54-82
• 3.1 实验材料与仪器54-55
• 3.1.1 实验对象54
• 3.1.2 试剂及仪器54-55
• 3.2 方法55-60
• 3.2.1 组织冰冻切片的制备55
• 3.2.2 间接免疫荧光实验(IIFA)55
• 3.2.3 石蜡切片的制备55-57
• 3.2.4 免疫组织化学染色(IHC)57-58
• 3.2.5 病毒感染及取样58-59
• 3.2.6 间接ELISA59-60
• 3.2.7 绝对荧光定量PCR60
• 3.2.8 血细胞中受体和病毒的分布60
• 3.3 结果60-80
• 3.3.1 间接免疫荧光定位27.8kDa受体蛋白的分布60-63
• 3.3.2 免疫组织化学染色定位27.8kDa受体蛋白的分布63-66
• 3.3.3 组织中27.8kDa受体蛋白感染病毒后的表达动态66-71
• 3.3.4 病毒感染后组织中LCDV粒子的变化动态71-77
• 3.3.5 感染后血细胞中病毒与27.8kDa受体蛋白的检测77-80
• 3.4 讨论80-81
• 本章小结81-82
• 4. 27.8kDa受体蛋白在LCDV感染牙鲆白细胞的意义82-94
• 4.1 材料与仪器82-83
• 4.1.1 实验材料82
• 4.1.2 试剂与仪器82-83
• 4.2 方法83-86
• 4.2.1 感染后牙鲆血细胞中LCDV与27.8 kDa受体蛋白检测83
• 4.2.2 免疫电镜83-84
• 4.2.3 流式细胞术84
• 4.2.4 LCDV体外感染牙鲆白细胞及电镜观察84-85
• 4.2.5 多荧光免疫染色85-86
• 4.3 结果86-91
• 4.3.1 感染病毒后全血细胞中27.8kDa受体及LCDV分布86
• 4.3.2 牙鲆外周血白细胞的采集86-87
• 4.3.3 免疫电镜87
• 4.3.4 流式细胞术87-88
• 4.3.5 LCDV体外感染白细胞的时间进程88-89
• 4.3.6 27.8kDa受体蛋白在LCDV感染白细胞中的作用89-90
• 4.3.7 CD3、IgM和IgD阳性白细胞的LCDV易感性检测90-91
• 4.4 讨论91-93
• 本章小结93-94
• 5. 牙鲆感染LCDV后鳃组织的转录组学研究94-119
• 5.1 材料与仪器94-95
• 5.1.1 实验动物与病毒94
• 5.1.2 试剂与仪器94-95
• 5.2 方法95-99
• 5.2.1 牙鲆攻毒实验95
• 5.2.2 RNA提取95-96
• 5.2.3 RNA质量检测96
• 5.2.4 文库构建、库检及上机测序96-97
• 5.2.5 生物信息学分析流程97
• 5.2.6 RNA-Seq数据的验证97-99
• 5.3 结果99-115
• 5.3.1 RNA质量检测99-100
• 5.3.2 测序数据质量汇总100
• 5.3.3 拼接转录本的长度分布100-101
• 5.3.4 基因功能注释101-104
• 5.3.5 CDS预测104-106
• 5.3.6 基因表达水平及差异基因分析106-110
• 5.3.7 差异表达基因的GO分类110-111
• 5.3.8 差异表达基因的KEGG分析111-112
• 5.3.9 病毒入侵及机体免疫应对感染的相关基因112-114
• 5.3.10 RNA-seq结果的qPCR验证114-115
• 5.4 讨论115-118
• 5.4.1 LCDV 27.8 kDa受体蛋白基因的差异表达116
• 5.4.2 差异表达的细胞因子及相关基因116-117
• 5.4.3 Toll样受体的应答变化117
• 5.4.4 细胞凋亡相关基因的变化117
• 5.4.5 获得性免疫相关基因117
• 5.4.6 其他抗LCDV感染基因117-118
• 本章小结118-119
• 总结119-121
• 参考文献121-133
• 致谢133-134
• 个人简历134
• 研究生期间的学术成果134

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本文编号：1089620