罗伊氏乳杆菌全基因组序列分析及其调节仔猪肠黏膜免疫功能的研究

发布时间：2017-10-25 12:08

  本文关键词：罗伊氏乳杆菌全基因组序列分析及其调节仔猪肠黏膜免疫功能的研究

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【摘要】：罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)15007,最初命名为发酵乳杆菌(L. fermentum)15007,是本实验室从健康猪肠道分离筛选的一株益生菌株,前期研究发现该菌具有很强的黏附能力,能够改善仔猪肠道健康。本文通过四个试验探讨L. reuteri15007发挥益生作用的遗传基础及其对仔猪肠黏膜免疫功能的影响。(1)利用全基因组鸟枪法对L. reuteri15007的全基因组进行测定,并对其进行生物信息学分析。研究表明,L. reuteri15007基因组由1条染色体和6个质粒组成,其中染色体长度为1,947,706bp,含1,891个编码序列、6个rRNA操纵子和69个tRNA基因；6个质粒长度在6.5～53.02kb之间,共含有163个编码序列。L. reuteri I5007具有完整的初级代谢途径,编码糖酵解途径的主要功能酶类、部分戊糖磷酸途径的酶类以及一些脂肪酸、氨基酸和核酸代谢相关的酶类。基因组上存在与耐酸、耐胆盐、抗氧化以及黏附相关的基因；另外,L. reuteri I5007编码两个胞外多糖合成基因簇。比较基因组结果显示,L. reuteri I5007染色体与已测序的L.reuteriJCM1112和DSM20016染色体相比存在倒置现象；另夕L. reuteri I5007含有330个独有基因、一个特有的胞外多糖合成基因簇以及一个成簇的、规律间隔的短回文重复序列。(2)试验二旨在研究L. reuteri15007的黏附特性并验证预测的黏附基因。研究表明,L. reuteri15007具有较强的疏水特性和自聚合能力,其黏附能力与细菌表面的蛋白和脂类成分相关；试验选取六个基因,成功构建重组子,其中LRI_352、RI_605成功表达并得到纯化蛋白,但LRI352(extracellular protein)和LRI_605(peptidase M23)蛋白不能黏附猪小肠上皮细胞。(3)试验三研究了L. reuteri15007在体外和体内对猪肠上皮细胞先天性防御肽表达的影响。体外试验表明,108CFU/mL的L. reuteriI5007作用猪源肠上皮细胞(IPEC-J2)6h可显著促进猪p-防御素(Porcine β-defensin, pBD)-2、 pBD-3、 pBD-114、 pBD-129和PG1-5的mRNA表达量(P0.05)。体内试验表明,L. reuteri I5007可以显著增加空肠中pBD-2和结肠中pBD-2、 pBD-3、 pBD-114和pBD-129的mRNA表达量(P0.05)；进一步研究发现L. reuteri I5007对肠道组织模式识别受体的表达没有影响.但是可以增加结肠内容物中丁酸的含量(P0.05),并可显著提高结肠组织中过氧化物酶体增殖物激活受体-γ和G蛋白偶联受体41的mRNA表达量(P0.05)。本试验说明L. reuteri15007刺激新生仔猪结肠防御肽的表达,可能是通过增加结肠内容物中短链脂肪酸的含量以及结肠短链脂肪酸受体发挥作用。(4)试验四以IPEC-J2细胞系为模型,旨在研究L. reuteri I5007刺激猪肠上皮细胞先天性免疫防御肽表达的同时是否会引起炎症反应。试验表明,L.reuteri I5007可显著提高IPEC-J2细胞Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)2、TLR6和TLR9的表达,并且能够显著刺激白介素-10和转化生长因子-p3的表达(P0.05),而对肿瘤坏死因子-α和白介素-6没有影响。另外,L.reuteri I5007可以显著降低E. coli K88对IPEC-J2细胞的定植黏附,显著抑制E.coli K88或脂多糖引起的肿瘤坏死因子-α和白介素-6的过表达,并且可以促进白介素-10的表达(P0.05); E.coliK88可以刺激pBD-2、 pBD-114、 pBD-129和PG1-5的mRNA表达,L. reuteri I5007-与E. coli K88对诱导猪肠上皮细胞先天性免疫防御肽的表达没有呈现协同或拮抗作用。综上,本研究对破译L.rewteri15007的作用机制提供了新的视角,同时也说明L. reuteri I5007是一株性能优异的益生菌株,清晰的遗传背景有利于今后菌种的改良和育种。L. reuteri I5007可通过提高仔猪结肠短链脂肪酸的含量来促进肠上皮细胞表达防御肽,改善肠道黏膜免疫功能,保证仔猪健康和生长；另外L. reuteri15007刺激猪肠道先天性免疫防御肽表达的同时不会诱发炎症反应,并且可以通过抑制E. coli K88定植黏附和调节免疫因子的表达来抑制E.coli K88引起的炎症反应。
【关键词】：罗伊氏乳杆菌 全基因组 仔猪 防御肽 黏膜免疫
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S816.7
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• ~.写词表（Abbreviations)13-15
• 第一章 绪论15-42
• 1.1 研究目的和意义15-16
• 1.2 国内外研究进展16-40
• 1.3 研究内容和方法40-42
• 第二章 试验研究42-110
• 试验一 L. reuteri I5007全基因组序列研究42-70
• 2.1.1 前言42-43
• 2.1.2 材料和方法43-46
• 2.1.3 结果与分析46-68
• 2.1.4 讨论68-69
• 2.1.5 小结69-70
• 试验二 L.reuteri I5007黏附特性及黏附基因功能验证70-83
• 2.2.1 前言70
• 2.2.2 材料与方法70-78
• 2.2.3 结果与分析78-81
• 2.2.4 讨论81-82
• 2.2.5 小结82-83
• 试验三 L. reuteri I5007对猪肠上皮细胞防御肽表达的影响83-99
• 2.3.1 前言83-84
• 2.3.2 材料和方法84-88
• 2.3.3 结果与分析88-95
• 2.3.4 讨论95-98
• 2.3.5 小结98-99
• 试验四 L. reuteri I5007对猪肠上皮细胞炎症反应的影响99-110
• 2.4.1 前言99-100
• 2.4.2 材料和方法100-102
• 2.4.3 结果与分析102-107
• 2.4.4 讨论107-109
• 2.4.5 小结109-110
• 第三章 结论与建议110-111
• 参考文献111-129
• 致谢129-130
• 个人简历130-132

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 苏少华;张玉秀;朱凌峰;李祥雷;高武斌;;近十年我国耐重金属细菌研究文献分析[J];农业图书情报学刊;2011年05期

2 Jae Sung Ko;Hye Ran Yang;Ju Young Chang;Jeong Kee Seo;;Lactobacillus plantarum inhibits epithelial barrier dysfunction and interleukin-8 secretion induced by tumor necrosis factor-a[J];World Journal of Gastroenterology;2007年13期

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本文编号：1093637