调控大豆E1基因表达的分子机理研究

发布时间：2017-10-26 05:05

  本文关键词：调控大豆E1基因表达的分子机理研究

  更多相关文章： 大豆 E1基因 表达特性 顺式作用元件 开花期 B3结构域

【摘要】：大豆生育期基因E1主要调控大豆的开花期及成熟期。本研究拟在对E1启动子区域的分子信息学研究的基础上,对E1基因的表达日节律变化及品种的E1基因表达的特点等进行相关研究,揭示E1基因表达的调控机理与E1基因的功能。主要研究结果如下:1.明确了大豆E1基因的表达节律研究通过每2小时取样来研究E1基因的日节律变化规律,在长日照条件下,E1基因的表达呈现双峰型,第一个高峰为黎明(光照)后2小时,第二个高峰的出现时间与其一致,为光照后16小时(为光照和黑暗的交替时间点)。相应地E1基因表达的日节律出现两个低谷,分别是光照后8~12小时和20~24小时。与之前的研究(Xia等,2012a)相比,第一高峰出现的时间提前了2个小时左右,这种差异可能是来自于取样间隔时间上的差异。通过连续光照及连续黑暗试验表明,光照条件能够促进E1基因的表达量,相反连续的黑暗条件能抑制E1基因的表达,致使其表达极低。长日照条件下E1基因的表达量的双峰型日节律变化规律及长短日照条件下表达量的巨大差别,主要受光反应调控,同时亦受制于生物钟节律。2.对E1基因上游序列进行生物信息学分析和5’侧翼序列缺失表达分析及酵母单杂交筛选上游结合因子对大豆E1基因及其两个同源基因的5’侧翼序列进行生物信息学分析,确定与光反应及生物钟节律相关的顺式作用元件是研究E1基因调控的基础。结果发现三个拷贝的上游序列-326bp~-1bp相似性大于85%。将E1基因5’侧翼序列的不同区段连接植物表达载体转化拟南芥,结果显示在E1基因上游-288bp~-1bp的区段就存在光反应特性。试验以E1基因和其两个同源基因相似性最大的-326bp~-1bp区段除去5’UTR序列-157bp~-1bp后的-326bp~-154bp区段为重点序列构建诱饵载体进行酵母单杂交试验,经酵母自激活检验后,以E1基因上游的两区段-288bp至-154bp与-364bp至-257bp序列为诱饵,利用酵母单杂交技术来筛选大豆的基因表达文库,鉴定出与其相互作用的结合蛋白。对候选结合蛋白进一步鉴定及相关的作用机理研究对明确E1基因的调控机理具有重要的意义。3.研究了不同遗传因素对E1基因表达的影响本研究以Kariyutaka(E1,E2-in,e3-T,e4)×垦丰18(E1,e2-ns,E3-Ha,E4)杂交群体后代为试验材料,在哈尔滨试验田(45o70'N,126o64'E)和海伦试验基地(47o26'N,126o38'E)种植,研究不同的E2、E3和E4的基因型组合对E1基因表达量的影响。试验结果显示,E1基因的表达丰度与开花期显著相关,在哈尔滨和海伦地区,E2、E3和E4基因为隐性纯合基因型的植株中E1基因表达量高于显性纯合植株中E1基因的表达量。单因素方差分析结果显示,在哈尔滨地区,E3基因和E4基因对E1基因表达量的影响小于E2基因的作用;而在较高纬度的海伦地区,E3基因和E4基因对E1基因表达量的影响大于E2基因的作用。试验说明E1基因的表达量直接影响植物开花期,而包括E2、E3、E4和未知基因在内的遗传因素可能通过调控E1基因的表达量来间接调控大豆开花时间。4.研究了E1基因突变型e1-b3a的亚细胞定位并进行功能验证在烟黄3号品种中发现了一个E1基因的新型基因型,B3结构域的中间位置发生了5bp突变,并产生终止密码子,定名为e1-b3a。在哈尔滨地区,e1-b3a的开花期较E1基因型提前30天,在淮安地区约提前10天。亚细胞定位研究表明,e1-b3a蛋白主要定位于细胞核中,这一亚细胞定位特性与E1蛋白相似而不同于e1-as蛋白。对e1-b3a基因型的相关研究,证明了B3结构域对E1基因的生物学功能具有重要作用。在大豆品种中现已发现了E1基因具有多个基因型,说明E1位点经历了较强的自然选择与人工选择。本研究揭示了E1基因的中枢调节功能,E1基因的多种功能相异的基因型及其不同的表达水平均影响着大豆的开花期。以E1基因的为中心的大豆生育期基因的调控网络赋予大豆品种具有能够适应不同的纬度及生态环境的光周期长度的生态适应性。
【关键词】：大豆 E1基因 表达特性 顺式作用元件 开花期 B3结构域
【学位授予单位】：中国科学院研究生院（东北地理与农业生态研究所）
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S565.1
【目录】：

• 摘要9-11
• Abstract11-14
• 第一章 绪论14-27
• 第一节 选题背景与意义14-16
• 第二节 国内外研究进展16-27
• 一、植物光周期途径及其分子调控研究进展16-20
• （一）植物光周期途径是重要的开花调控途径16
• （二）光周期反应与大豆生长适应性相关16-18
• （三）光周期途径分子调控机制研究进展18-20
• 二、大豆生育期基因的功能和QTL定位20-21
• （一）大豆生育期基因的功能20
• （二）大豆生育期基因的QTL定位20-21
• 三、大豆生育期相关基因的分子克隆21-23
• （一）大豆生育期E1 基因的分子克隆21-22
• （二）大豆生育期E2 基因的分子克隆22-23
• （三）大豆光敏色素基因E3 和E4 基因的分子克隆23
• 四、植物启动子研究进展23-27
• （一）启动子的种类23-24
• （二）启动子的顺式作用元件24-25
• （三）植物基因光反应元件25-27
• 第二章 大豆E1 基因的表达节律研究27-34
• 第一节 材料与方法27-29
• 一、试验材料和材料处理27
• 二、试验方法27-29
• 第二节 试验结果和分析29-33
• 一、总RNA的提取和反转录29-31
• 二、PCR检测31-33
• 第三节 本章小结33-34
• 第三章大豆E1 基因上游序列分析及酵母单杂交筛选上游结合因子34-69
• 第一节 材料与方法34-50
• 一、试验材料34-38
• （一）载体构建相关材料34-36
• （二）转化拟南芥相关材料36-37
• （三）酵母单杂交相关材料37-38
• （四）生物软件和数据库38
• 二、试验方法38-50
• （一）载体构建38-42
• （二）转化拟南芥42-44
• （三）转基因拟南芥的表达分析44-46
• （四）酵母单杂交筛库46-50
• 第二节 试验结果与分析50-67
• 一、E1 基因上游序列生物信息学分析50-59
• （一）E1 基因上游序列比对50-56
• （二）E1 基因上游序列顺式作用元件分析56-59
• 二、大豆E1 基因 5’侧翼序列缺失表达分析59-63
• （一）不同区段植物表达载体的构建59-60
• （二）冻融法转化农杆菌60-61
• （三）拟南芥抗性植株的筛选61-62
• （四）转基因拟南芥的表达分析62-63
• 三、酵母单杂文库筛选63-67
• （一）诱饵载体构建63-64
• （二）诱饵载体自激活验证及 3-AT浓度的确定64-65
• （三）阳性克隆确定和测序65-67
• 第三节 本章小结67-69
• 第四章 不同遗传背景影响E1 基因表达量69-85
• 第一节 材料与方法69-72
• 一、试验材料69-70
• （一）植物材料69
• （二）试验试剂69-70
• （三）数据分析软件70
• 二、试验方法70-72
• （一）开花期的调查70
• （二）DNA提取70-71
• （三）RNA提取及检测71
• （四）qRT-PCR检测E1 基因表达量71
• （五）E2、E3 和E4 基因的基因型鉴定71-72
• （六）数据分析72
• 第二节 结果与分析72-83
• 一、E1 基因表达量与开花期的关系72-74
• （一）E1（e1-as）基因表达量与开花期呈负相关72-74
• （二）杂交群体中E1 基因表达量与开花期呈负相关74
• 二、不同E2、E3、E4 基因型与E1 基因表达量的关系74-81
• （一）不同基因型组合的植株中E1 基因的表达量74-75
• （二）E2、E3、E4 基因型与E1 基因表达量的关系75-78
• （三）不同E3、E4 基因型组合与E1 基因表达量的关系78-79
• （四）不同E2、E3、E4 基因型与开花期的关系79-81
• 三、其他开花基因表达量与E1 基因的表达量和开花期的关系81-83
• 第三节 本章小结83-85
• 第五章 e1-b3a亚细胞定位及功能验证85-94
• 第一节 材料和方法85-87
• 一、试验材料85
• 二、试验方法85-87
• （一）e1-b3a基因型的鉴定85
• （二）e1-b3a亚细胞定位85-86
• （三）开花期的调查86
• （四）数据分析86-87
• 第二节 试验结果与分析87-93
• 一、e1-b3a基因型及CAPS标记87-89
• （一）e1-b3a等位变异结构分析87-88
• （二）e1-b3a基因型CAPS标记88-89
• 二、e1-b3a的亚细胞定位89
• 三、e1-b3a等位变异对开花期的影响89-93
• 第三节 本章小结93-94
• 讨论94-102
• 结论102-103
• 参考文献103-111
• 发表文章目录111-112
• 致谢112-113

，

本文编号：1097135