西瓜根系渗透胁迫下转录组与microRNA分析及相关基因功能研究

发布时间：2017-12-07 03:06

  本文关键词：西瓜根系渗透胁迫下转录组与microRNA分析及相关基因功能研究

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【摘要】：干旱是影响作物产量和品质的重要环境因子之一。我国干旱和半干旱区域约占国土面积的50%。而在湿润的地区也会遭受到季节性和周期性的干旱。在解决干旱问题的方法中,培育抗旱耐旱新品种是重要的手段之一。而抗旱耐旱新品种的培育就要求我们了解作物对干旱胁迫的响应和调控机制。根系在植物吸收水分、营养物质及感受水胁迫信号中发挥重要作用,同时也是受干旱影响最大的器官,故了解根系对干旱胁迫的响应和应对具有重要意义。西瓜[Citrullus lanatus(Thumb.)Matsum.Nakai.]是一种重要的水果型经济园艺作物,其栽培面积占世界蔬菜栽培面积的7%。西瓜整个生长期需要大量水分,季节性干旱及频繁发生的自然干旱严重影响了西瓜的产量、品质,甚至整个西瓜产业的发展。M08是一个经鉴定较为抗旱的西瓜自交系。本研究以M08根系为材料,用20%PEG模拟干旱胁迫,采用Illumina Hiseq 2500平台对胁迫后的根系进行转录组、miRNA及降解组测序和分析,其结果为了解西瓜根系响应、应对渗透胁迫机制和西瓜抗旱耐旱遗传改良提供了基础信息。同时对脯氨酸合成相关酶的活性及编码基因表达模式进行了研究,明确了脯氨酸的长距离运输方式,并将脯氨酸合成限速酶P5CS编码基因转拟南芥进行了功能研究。本研究主要结果如下:(1)采用Illumina Hiseq 2500平台对20%PEG胁迫6 h的根系及对照进行转录组测序,共得到了32.99 Gb数据,超过40M条长125bp的pair-end reads。有5246个差异表达基因,其中2753上调表达,2493下调表达。在差异表达基因中有5175个基因获得注释。GO分析结果显示这些差异表达基因涉及到了信号传递、渗透调节、活性氧清除、转录因子、植物激素、蛋白合成和细胞分裂等过程。在KEGG分析中,825个差异表达基因可分到108个不同的通路中。核糖体、植物激素信号、植物-病原体互作、嘌呤代谢及淀粉和糖代谢等通路中包含了大部分差异表达基因,其中核糖体途径被显著改变。(2)采用Illumina Hiseq 2500测序平台对西瓜根系PEG胁迫后其miRNA水平上的响应进行了研究,同时利用生物信息学预测和降解组测序的方法对测序得到的miRNA的靶基因进行了预测。在对照文库S01、S02、S03和胁迫处理文库S04、S05S06文库中分别得到了14,662,351、14,263,084、15,767,557、16,743,057、16,615,676、13,354,601和27,618,848个clean reads,通过质量控制,每文库的Clean Data均大于13.35M,且Q30值均大于91%。在6个样品中总共预测到了1060个新miRNA,其长度以24 nt为主。对这1060个miRNA的靶基因进行预测,其中174个miRNA预测到了456个靶基因。在这预测到的456个靶基因中,有241个基因获得了注释信息。差异表达的miRNA有42,其中上调表达的为20个,下调为22个。在差异表达表达miRNA的75个靶基因中,只有14个基因得到了注释。在降解组文库中,共检测到了66个靶基因降解位点和66个靶基因发生了降解。与miRNA测序预测的靶基因取交集,得到了28个共有靶基因,这28个共有靶基因涉及了SPL、HD-Zip转录因子及植物激素信号传递。(3)西瓜植株在PEG胁迫下,其茎和叶中脯氨酸含量逐渐增加,后在12 h下降;而在根中,在第3 h达到最大,后开始下降。脯氨酸合成相关酶的酶活性及其编码基因的相对表达量结果表明,PEG胁迫下西瓜植株中脯氨酸合成以谷氨酸途径为主,在2个P5CS编码基因中,以Cla006553为主,Cla017928表达被抑制。P5CS活性变化与Cla006553相对表达量变化相似。OAT酶活性较小,而其编码基因的表达在根、茎叶中均被抑制。截断地上部和地下部分并进行干旱胁迫,其试验结果表明叶是脯氨酸合成的主要场所,在胁迫下根中脯氨酸依靠叶中脯氨酸长距离运输到根部。对Cla006553和Cla017928的启动子驱动GUS的转基因拟南芥胁迫后染色发现,在拟南芥叶中Cla006553的启动子活性最高,在根中活性低。而Cla017928的启动子在胁迫后,根、叶中的活性均较低。这更进一步表明,PEG胁迫下西瓜主要以Cla006553编码P5CS酶,脯氨酸以叶为主要合成器官。(4)克隆了西瓜自交系M08的P5CS酶两个编码基因:Cla006553和Cla017928。Cla006553的编码序列长2166bp,编码721个氨基酸;Cla017928的编码序列长2145bp,编码714个氨基酸。二者核酸和氨基酸序列之间相似性为分别为74.19%和77.12%。其蛋白含有谷氨酸激酶功能域、ATP结合区、NAD(P)H结合区、亮氨酸拉链、谷氨酰脱氢酶功能区(G5PR)等结构域和脯氨酸反馈抑制位点。转Cla006553和Cla017928基因的拟南芥植株可显著增加脯氨酸含量,具有较高的耐旱和耐盐能力。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S651

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