杀虫剂多杀菌素引起昆虫细胞死亡的分子机制研究

发布时间：2017-12-08 10:34

  本文关键词：杀虫剂多杀菌素引起昆虫细胞死亡的分子机制研究

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【摘要】：多杀菌素是由刺糖多孢菌发酵产生的大环内脂类杀虫抗生素。因其具有杀虫效率高,无交互抗性,对非靶标生物毒性低和环境友好等优点,多杀菌素已广泛应用于农作物害虫综合治理,以及仓储害虫防控和畜类寄生虫防治。自噬,基因控制下的自主性有序细胞死亡,是细胞对其内部衰老或受损的细胞器,错误折叠的蛋白质以及侵入的病原体进行降解的生物学过程,在多细胞生物生长发育,结构重建,维持细胞内稳态等过程中起重要作用。多杀菌素诱导自噬的研究尚未见报道,其潜在的分子机制有待于进一步探讨。为此,本研究将Sf9细胞暴露于多杀菌素,重点研究了线粒体损伤及自噬效应的诱导,并对其分子机制进行了探究。本文研究证实,多杀菌素对Sf9细胞的增殖抑制作用呈剂量依赖效应,当浓度达到40μmol/L时该抑制作用到达极显著水平(p0.01)。60μmol/L多杀菌素可诱导Sf9细胞发生细胞质空泡化和细胞核固缩等形态变化,并伴随着ROS累积以及线粒体功能紊乱,如线粒体通透性转换孔开放、线粒体膜电位崩溃等。同时,多杀菌素可以诱导Sf9细胞Bcl-2/Bax比率显著降低,引起mPTP依赖性和非依赖性细胞色素C释放,触发Caspase级联反应。50μmol/L的CsA预孵Sf9细胞18h,可部分抑制由多杀菌素诱导的细胞色素C的释放,并有利于减弱细胞质空泡化。本文另一研究重点是探明多杀菌素诱导细胞自噬的分子机制,MDC荧光染色和细胞超微结构观察证实60μmol/L多杀菌素诱导Sf 9细胞中自噬体形成。为进一步验证此结论,本文用60μmol/L多杀菌素作用于Sf 9细胞,分别检测到自噬相关蛋白Beclin 1表达增加、LC3-B蛋白转化率上升和p62蛋白被降解。自噬抑制剂3-MA预孵Sf 9细胞,结果表明自噬被抑制后由多杀菌素诱导的Sf9细胞自噬体形成被减弱,Sf9细胞的增殖抑制被逆转了 36.7%,证实自噬发生导致了细胞内自噬体的累积,并介导了细胞的死亡。为了探究溶酶体在多杀菌素诱导的Sf9细胞自噬过程中的作用,荧光双标法观察到线粒体和溶酶体的共定位,并检测线粒体自噬相关蛋白PINK1和Parkin蛋白表达,证实线粒体自噬的发生。60μmol/L多杀菌素作用于Sf 9细胞,诱导溶酶体膜蛋白Lamp 2表达增加,且溶酶体组织蛋白酶CathepsinB和CathepsinLmRNA表达同步增加证实溶酶体参与损伤线粒体清除过程。多杀菌素处理引起Sf 9细胞ATP含量降低,并诱导AMPK和TSC2蛋白的磷酸化增强以及mTOR和p70S6K蛋白的磷酸化减弱,表明多杀菌素诱导的Sf细胞线粒体自噬伴随着AMPK/mTOR信号通路的激活。此外,研究了多杀菌素诱导的Sf9细胞氧化应激和DNA损伤。结果显示,60μmol/L多杀菌素作用于Sf9细胞,导致细胞内MDA含量增加,SOD、CAT活性显著降低,但GST活性上升不明显,证实细胞内产生氧化应激。多杀菌素导致细胞核8-oxoG的生成增加,并进一步诱导DNA修复酶OGG1和MTH1的表达上升,证实DNA的氧化损伤。中性彗星电泳和微核化分析,判定多杀菌素处理的细胞中出现DNA双链断裂和染色体畸形等严重氧化损伤。
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S482.3

【参考文献】

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1 侯文杰;李飞;吴青君;徐宝云;张友军;;西花蓟马对多杀菌素的抗性生化机制研究[J];应用昆虫学报;2013年04期

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本文编号：1266067