番茄GDP-L-半乳糖磷酸酶基因SlGGP-LIKE的功能分析

发布时间：2017-12-10 05:00

  本文关键词：番茄GDP-L-半乳糖磷酸酶基因SlGGP-LIKE的功能分析

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【摘要】：番茄起源于热带,是喜温类蔬菜,因此当气温较低时,番茄生长发育迟缓,影响茎、叶生长,长时间的低温环境则会导致植株死亡。同时,低温影响根系对磷、钙、钾、镁等营养元素的吸收和利用,使叶片黄化加剧。低温条件会导致细胞膜透性降低,活性氧增加,酶系功能改变,引起细胞代谢的变化和功能紊乱,发生低温生理伤害。抗坏血酸(Ascorbic acid,AsA)又叫维生素C(Vitamin C,Vc),是一种水溶性抗氧化有机小分子,在植物中广泛存在,参与体内活性氧清除,调控细胞分裂和细胞生长,并可作为某些氧化还原酶的辅酶参与多种生理过程。在人体内,抗坏血酸是高效的抗氧化剂,可以保护身体免于自由基的威胁,维持免疫功能,提高免疫力。另外,在环境变化时,番茄极易染病,导致番茄植株萎蔫,黄化矮缩,严重时会造成番茄果实大面积腐烂,从而导致作物减产。GDP-L-半乳糖磷酸酶(GGP)是植物抗坏血酸L-半乳糖途径合成的关键酶之一。近几年来在植物衰老和逆境胁迫研究中,抗坏血酸作为生物体内对自由基伤害产生的相应保护系统成员之一,更引起了人们的研究兴趣。因此,研究番茄GGP基因的功能,具有重要的科学意义。本研究从番茄中克隆了一个细胞核定位的抗坏血酸合成基因(SlGGP-LIKE),并以转反义SlGGP-LIKE的番茄和过表达SlGGP-LIKE的烟草为材料,探讨了SlGGP-LIKE基因在耐低温、病原菌和氧化胁迫等方面的功能。主要结果如下:(1)从番茄叶片中分离得到SlGGP-LIKE基因(GenBank序列号:XM_004231938.2),该基因全长为2092bp,开放阅读框为1317bp,编码438个氨基酸,具有两个保守区-HIT(histidine triad)序列和NLS(nuclear localization sequence)序列。预测分子量为49kDa,该基因位于番茄2号染色体上。(2)RT-qPCR分析发现,SlGGP-LIKE在番茄的根、茎、叶、花和果实中均有表达,其中,该基因在叶片中的表达量最高。同时,低温、MV、强光、NaCl、SA和病原菌均可诱导SlGGP-LIKE表达。(3)构建SlGGP-LIKE-GFP融合蛋白并瞬时转化本生烟幼苗,通过Confocal观察发现SlGGP-LIKE蛋白定位于细胞核。(4)构建了pET-SlGGP-LIKE原核表达载体,在大肠杆菌BL21中成功诱导SlGGP-LIKE蛋白表达,制备抗体,效价为1:300,并用于Western blot实验。(5)将SlGGP-LIKE基因的编码区连入含有35S启动子的pBI121载体,重组构建了SlGGP-LIKE的过表达和抑制表达载体。利用农杆菌介导的叶盘法转化番茄和烟草,获得反义转基因番茄植株和过表达SlGGP-LIKE的烟草植株。通过PCR、RT-qPCR以及Western杂交的方法对得到的转基因植株进行检测,结果表明成功获得了SlGGP-LIKE过表达和抑制表达的转基因番茄植株和转基因烟草植株。通过进一步对转基因植株的检测发现,转反义番茄AsA含量与野生型番茄相比明显下降,转正义烟草AsA含量升高了将近两倍。(6)通过检测反义株系抗坏血酸合成途径(L-半乳糖途径)中其他相关酶基因的表达量,发现位于SlGGP-LIKE上游的基因,如GPI和GME基因的表达上调。特别是GGP基因,表达量明显上调。相反的,在SlGGP反义植株中,SlGGP-LIKE表达量上调不如GGP基因明显。因此我们推测在L-半乳糖途径中,两个基因相比较,GGP的表达更为重要。(7)低温胁迫下,反义SlGGP-LIKE番茄生长受到抑制的程度更为严重,PSII最大光化学效率、净光合速率、P700的氧化状态和D1蛋白含量与WT植株相比下降的更为明显。并且反义植株积累了更多的活性氧,膜脂伤害程度更为严重,叶黄素循环的脱环氧程度更低。(8)用丁香假单胞病原菌侵染转基因反义番茄和WT植株后,病原菌对转基因植株的伤害程度明显小于WT植株。通过台盼蓝染色以及菌落数量统计结果,均说明转基因番茄对病原菌的抗性强于WT植株。病原菌侵染后,转基因植株出现明显的H2O2的快速累积的现象。通过RT-qPCR检测发现,抗病基因PR1和NPR1基因在转基因植株中表达量明显高于WT植株,同时转基因番茄株系中水杨酸合成途径关键基因ICS的表达量明显高于WT植株。这说明SlGGP-LIKE参与了抗病响应,并且是通过H2O2作为信号物质诱导的水杨酸合成途径增强了转基因番茄的病原菌抗性。(9)过表达SlGGP-LIKE明显提高了转基因烟草AsA含量,减少了转基因烟草在氧化胁迫下H2O2和O2?-的积累。与WT植株相比,转基因植株生长状况更好,叶圆片失绿更轻,并且具有相对较高的PSII最大光化学效率、净光合速率和D1蛋白含量。因此,过表达SlGGP-LIKE能够增强转基因烟草对氧化胁迫的抗性。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q943.2;S641.2

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本文编号：1273175