通过大豆毛状根体系快速验证GmNAC08、GmNAC06和GmNAC15的基因功能

发布时间：2017-12-10 04:30

  本文关键词：通过大豆毛状根体系快速验证GmNAC08、GmNAC06和GmNAC15的基因功能

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【摘要】：目的:大豆[Glycine max(L.)merrill.]是重要的油料作物,盐胁迫是限制其产量的主要因素之一,了解大豆耐盐分子机制对于增加大豆耐盐能力具有重要作用。植物响应盐胁迫受到一个复杂的网络调控,这其中转录因子(TFs)起到了重要作用。NAC[No apical meristem(NAM),Arabidopsis transcription activation factor(ATAF),Cup-shaped cotyledon(CUC)]是植物特有的一个转录因子家族,由N端保守的DNA结合区域和C端多变的转录激活区域组成。NAC转录因子不仅与植物的生长发育有关,同时也涉及到植物对生物与非生物胁迫的响应。因此,研究NAC在响应盐胁迫时的功能对于提高大豆耐盐能力具有重要作用。方法:在本研究中没有用传统的遗传转化方法研究基因功能。传统的遗传转化方法具有转化效率低,过程复杂,易污染,周期长等缺点,发根农杆菌(A.rhizogenes)介导的毛状根遗传转化体系可以有效的解决这些问题,另外此法可以研究根特异性表达基因。用同源重组方法将GmNAC08(Glyma08g18470.1)、GmNAC06(Glyma06g21020.1)与GmNAC15(Glyma15g40510.1)克隆到pCAMBIA3301载体35S启动子下游,同时构建GmNAC08和GmNAC06的突变体表达载体。然后转入发根农杆菌K599形成复合体植株。复合体包含野生叶片和转基因毛状根,用于基因功能研究。结果和结论:(1)GmNAC08:qRT-PCR和RT-PCR检测GmNAC08在大豆不同组织的表达量,结果表明GmNAC08在根和子叶中的表达高于其它组织。GmNAC08在根中响应盐、旱与冷胁迫。GmNAC08在叶片中响应盐、旱、外源ABA与冷胁迫。不同的盐浓度梯度处理四周后,qRT-PCR和RT-PCR检测大豆根和叶片中GmNAC08的表达量,表明GmNAC08在第四周响应盐胁迫。250mM NaCl连续处理大豆复合体植株两周,每周浇3次NaCl溶液,结果显示过表达复合体(Overexpression composite,OE)植株耐盐能力增加,突变体复合体(CRISPR/Cas9 composite,Mutant)耐盐能力减弱。用DAB、NBT与台盼蓝对过表达复合体、空载对照复合体(vector control composite,VC)和突变体复合体叶片进行染色以及叶绿素含量和电解质渗出率的测定,表明复合体中转基因毛状根可以影响野生型叶片的功能。qRT-PCR和RT-PCR检测过表达复合体植株中毛状根和叶片中GmNAC08的表达量,结果表明毛状根中过表达GmNAC08并不能影响叶片中GmNAC08的表达量。丙二醛含量测定,甜菜碱含量测定以及在正常生长条件下过表达GmNAC08毛状根中盐胁迫抗性基因GmWRKY54、GmERF3、GmREF7与GmMYB177表达量的提高说明GmNAC08在植物盐胁迫的应答反应中发挥着重要作用。烟草瞬时表达证明GmNAC08是miR164a的靶基因。(2)GmNAC06:qRT-PCR和RT-PCR检测GmNAC06在大豆不同组织的表达量,结果表明,GmNAC06在根和子叶中的表达高于其它组织。GmNAC06在根中响应盐和冷胁迫。GmNAC06在叶片中响应盐、旱、外源ABA与冷胁迫。不同的盐浓度梯度处理四周后,qRT-PCR和RT-PCR检测大豆根和叶片中GmNAC06的表达量,表明GmNAC06在第四周响应盐胁迫。250mM NaCl连续处理大豆复合体植株两周,每周浇3次NaCl溶液,结果显示过表达复合体植株耐盐能力增加,突变体复合体耐盐能力降低。用DAB和NBT对过表达复合体、空载对照复合体和突变体复合体叶片进行染色,检测叶片中H2O2和O2-的积累,结果表明过表达复合体的叶片可以较为有效的清除活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS),而突变体复合体的叶片受到ROS伤害比空载对照复合体更严重。台盼蓝染色表明盐胁迫导致突变体复合体的叶片细胞死亡最严重,可能与ROS的积累有关系。叶绿素含量和电解质渗出率的测定表明复合体中转基因毛状根可以影响野生型叶片的功能。qRT-PCR和RT-PCR检测发根农杆菌侵染一个月的过表达复合体中根和叶片的GmNAC06表达量,结果表明毛状根中过表达GmNAC06并不能影响叶片中GmNAC06的表达量。丙二醛含量测定表明在毛状根中过表达GmNAC06可以较为有效的清除ROS。甜菜碱含量测定表明在毛状根中过表达GmNAC06可以积累渗透调节物质提高复合体植株耐盐能力。另外,在正常生长条件下过表达GmNAC06毛状根中盐胁迫抗性基因GmUBC2和GmHKT1表达量提高。这些数据说明过表达GmNAC06可以增加复合体植株耐盐能力。(3)GmNAC15:qRT-PCR和RT-PCR检测GmNAC15在大豆不同组织的表达量,结果表明GmNAC15在根和子叶中的表达高于其它组织。GmNAC15在根和叶片中响应盐、旱、外源ABA与冷胁迫。为了分析GmNAC15的基因功能,250mM NaCl连续处理大豆复合体植株两周,每周浇3次NaCl溶液,结果显示过表达复合体植株耐盐能力增加。用DAB、NBT、台盼蓝对过表达复合体和空载对照复合体叶片进行染色以及叶绿素含量的测定,表明复合体中转基因毛状根可以影响野生型叶片的功能。qRT-PCR和RT-PCR检测过表达复合体毛状根和叶片中的GmNAC15表达量,结果表明毛状根中过表达GmNAC15并不能影响叶片中GmNAC15的表达量。丙二醛含量测定,甜菜碱含量检测以及在正常生长条件下过表达GmNAC15毛状根中盐胁迫抗性基因GmERF3和GmWRKY54表达量提高。这些数据说明过表达GmNAC15可以增加复合体植株耐盐能力。综上所述,毛状根过表达GmNAC08、GmNAC06和GmNAC15增加复合体耐盐能力,转基因毛状根影响叶片功能。GmNAC08、GmNAC06和GmNAC15在大豆耐盐机制中是一个正向调控因子。
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S565.1

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