棉花异质型ACCase基因家族鉴定与功能分析

发布时间：2017-12-10 04:01

  本文关键词：棉花异质型ACCase基因家族鉴定与功能分析

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【摘要】：棉花是重要的经济作物和油料作物。棉籽中含有丰富的脂肪酸,可用于加工食用油、工业原料和生物柴油。异质型ACCase(heterromeric Acetyl-CoA carboxylase,ACCase)是各种脂肪酸从头合成的限速酶和关键酶,它由生物素羧化酶(BC)、生物素羧基载体蛋白(BCCP)及羧基转移酶(CT)的2个亚基α-CT和β-CT组成。本研究是在棉属(Gossypium)二倍体种(雷蒙德氏棉、亚洲棉)和四倍体种(陆地棉、海岛棉)基因组测序完成的基础上,对棉花异质型ACCase的三个核基因组编码的亚基基因家族进行全基因组水平鉴定和比较;在低温和盐胁迫处理下,雷蒙德氏棉、亚洲棉(石系亚1号)和陆地棉(TM-1)中所CCP基因响应的方式存在差异;结合公共数据中陆地棉(G.hirsutum)TM-1胁迫条件下的RNA-Seq数据,探究BCCP、BC和CTα基因家族成员在不同非生物胁迫下的应答反应。对GhBCCP1蛋白亚细胞预测结果进行验证,并克隆其上游1.5kb的启动子序列,进行缺失系列载体构建和活性研究。对Xu244(转基因受体材料)中异质型ACCase四亚基基因在各组织和不同非生物胁迫中的表达模式进行分析。对异质型GhACCase四亚基中过表达单基因转化材料进行筛选、油分测定,两两聚合。取得的主要研究结果如下:1.从雷蒙德氏棉、亚洲棉、陆地棉和海岛棉全基因组数据中分别鉴定出24个BCCP基因(4个GaBCCP、4个 GrBCCP、8 个 GhBCCP和 8 个 GbBCCP)、12 个 BC基因(2 个 GaBC、2 个 GBBC、4 个 GhBC 和 4 个 GbBC)和 11 个 CTα基因(3 个 GaCTα、2 个 GrCTα、4 个GhCTα和2个GbCTα),均以单个基因的形式分布在染色体上。亚洲棉中CTα基因比雷蒙德氏棉中多1个,陆地棉CTα基因比海岛棉中多2个。对四个棉种中BCCP基因成员进行系统进化分析,结果表明BCCP基因家族可分为2个组;组Ⅰ中基因长度比组Ⅱ中的变化大,两个组的基因结构比较复杂;基因复制结果表明,片段复制是导致陆地棉和海岛棉中BCCP基因数目扩增的主要原因。四个棉种间分别成功鉴定出20组、6组和6组BCCP、BC和CTα直系同源基因,其中分别有11组、3组和3组BCCP、BC和CTα直系同源基因结构非常相似,剩余9组BCCP、3组BC和3组CTα直系同源基因结构存在差异,推测大多数直系同源基因的基因结构保守性一般。2.雷蒙德氏棉、亚洲棉(石系亚1号)和陆地棉(TM-1)中16个BCCP基因在盐胁迫24h后,6个BCCP基因在根中表达上调,在茎中,雷蒙德氏棉和亚洲棉中的BCCP基因盐胁迫24h后表达上调;低温胁迫下,GrBCCP3、GaBCCP1、GaBCCP2、GaBCCP3、GaBCCP4 和 GhBCCP7在根中诱导上调表达。GrBCCP3、GaBCCP1、GaBCCP3和GaBCCP4低温胁迫24h后,在茎中上调表达;同时发现在盐和低温胁迫24h后,GrBCCP3、GaBCCP1、GaBCCP2和GaBCCP4在茎中均表达上调,GaBCCP1和GaBCCP3在叶片中均诱导表达。基于TM-1不同组织和不同非生物胁迫的RNA-Seq数据,对陆地棉中8个BCCP、4个BC和4个CTα基因进行转录本分析,结果表明它们在检测的组织中均有表达,其中4个BCCP基因(GhBCCP2、GhBCCP4、GhBCCP6和 GhBCCP7)、2 个BC基因(GhBC和 GhB3)和 2 个 CTα 基因(GhCTα1 和 GhCTα3)在不同发育时期的幼胚中转录水平较高,这些基因可能对脂肪酸积累起到积极作用;在不同非生物胁迫下,GhBCCP1在盐胁迫、干旱胁迫处理下呈现升-降-升趋势,表明GhBCCP1基因在这两种胁迫中可能受到反馈调节作用;在盐胁迫、干旱和热胁迫处理下,GhBCCP5和GhBCCP6下调表达,可能起负调控作用;热胁迫处理下陆地棉中4个GhBC上调表达,说明这4个GhBC基因在热胁迫下起正向调控作用;热胁迫、干旱和盐胁迫处理12h后,陆地棉中GhCTα1、GhCTα3和GhCTα4基因上调表达,可能这三个基因在这三种胁迫下起正向调控作用。这些结果表明GhBCCP、GhBC和GhCTα基因成员确实参与不同非生物胁迫的应答反应。3.GhBCCP1蛋白定位在叶绿体上,GhBCCP1启动子系列缺失片段研究发现,在1449-1195 bp之间存在比较重要的DOF核心元件和1个MYB元件,它们对启动子活性有很大的影响。4.异质型GhACCαse四个亚基基因在Xu244材料的根、茎、叶和纤维不同发育时期的组织中均有表达,但表达水平不同,其中GhCTβ在叶片中的表达量最高,推测可能是叶片中叶绿体含量比较丰富。在ABA处理12h后,GhBCCP1、GhBC1、GhCTα2和GhCTβ均上调表达,推测在ABA处理12 h后这四个基因可能协同响应ABA处理,而在低温和MeJA处理下表达模式并不一致,暗示异质型ACCase四个亚基在低温和MeJA处理下有不同的应答机制。5.八份材料的棉仁油分含量测定结果表明,棉仁在20-30 DPA阶段油分积累速度最快,30-35 DPA阶段油分积累速度变慢,35-40 DPA阶段有4份材料棉仁油分含量开始下降;8份棉花材料幼胚的不同发育时期,异质型GhACCase四个亚基基因表达结果显示,棉仁油分含量较高的材料,四个基因表达高峰集中在幼胚发育的同一时期,如10H1041的油分含量为35.29%,四个亚基表达高峰均在幼胚发育的25 DPA;棉仁油分含量相对高的材料,三个基因表达高峰出现在幼胚发育的同一时期,如11-0514和10H1007的油分含量分别为29.51%和29.69%,GhBCCP1、GhBC1和GhCTα2表达高峰均在幼胚发育的35 DPA,10H1014材料的油分含量为33.55%,GhBCCP1、GhBC1和GhCTα2表达高峰在幼胚发育的25DPA;棉籽油分含量低的材料,两个基因表达高峰在同一个时期(GhBCCP1和GhhC1、GhCTα2和GhCTβ表达高峰分别在幼胚发育的不同时期)或四个亚基表达高峰均不在一个时期,如Xu244、11-0711、11-0509和11-0512。这些结果表明棉籽油分含量高的棉花材料,异质型ACCase四个亚基基因在种子油分积累的主要时期倾向于协同表达,而在棉籽油分含量低的材料中,其在油分积累的主要时期协同表达趋势较弱。6.过表达异质型GhACCase的单个亚基材料中,T3代GhBCCP1转基因株系油分含量增加21.92%,达到显著水平;GhBC1转基因株系和GhCTβ转基因株系的油分含量均约增加17%,达到显著水平;GhCTα2转基因株系的油分含量较受体材料未达显著水平。说明过表达GhBCCP1、GhBC1和GhCTβ基因均能提高棉籽油分,而GhCTα2基因提高油分的功能有待进一步研究。转GhCTβ基因的T5代棉仁平均含油量较对照提高4.27百分点,过表达GhBCCP1和GhBC1的T5代转基因材料棉仁平均油分含量较对照分别提高1.01和1.67个百分点,GhCTα2的T5代转基因材料比对照平均降低0.51个百分点,本研究中T6和T9代四个亚基转基因材料油分结果与T5代的结果基本一致。这些结果表明分别过表达GhCTβ、GhBC1和GhBCCP1单亚基对提高棉仁油分具有一定的潜能。GhBCCP1×GhCTβ的两个聚合株系成熟期棉仁油分含量与亲本无显著区别,而GhCTβ×GhBC1和GhBCCP1×GhCTα2聚合材料成熟期的棉仁油分含量显著低于亲本材料。这些结果表明目前两两聚合的亚基转基因材料没有显著提高油分含量,其原因可能是两聚合的转基因植株体内没有提高ACCase的活性,将四个亚基全部聚合在一起进行过表达或许可以提高棉籽油分含量,但这推论还需进一步的研究。
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S562

【参考文献】

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本文编号：1273009