独脚金内酯在甜瓜抗列当机理和对列当种子萌发调控的研究

发布时间：2017-12-13 18:36

  本文关键词：独脚金内酯在甜瓜抗列当机理和对列当种子萌发调控的研究

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【摘要】：研究目的为了明确甜瓜独脚金内酯合成相关的两个关键基因Cm CCD7和Cm CCD8在独脚金内酯合成中的作用,以及这两个基因沉默后甜瓜对埃及列当(Phlipanche aegyptiaca)种子萌发率的影响情况。同时为了明确预培养处理和独脚金内酯诱导后列当种子萌发相关功能基因的表达变化。最终为埃及列当的防治提供理论与技术依据。研究方法通过对其他植物的独脚金内酯合成相关的CCD7和CCD8基因序列分析,依据这两个基因的保守序列设计简并引物,通过PCR扩增甜瓜上这两个基因的保守区段,再通过RACE技术获取其侧翼序列。通过ORF finder预测这两个基因的ORF、DNAMAN分析核酸信息、Proprarm预测蛋白质理化性质、Antheprot预测二级结构、SWISSMODEL预测蛋白质三级结构、BLASTN进行同源比对并用MEGA软件进行系统进化分析。分别对不同日龄甜瓜子叶,不同激素、不同激素浓度对甜瓜子叶的分化能力试验,最后测试甜瓜子叶对Cef和Kan两种抗生素的耐受能力以及对不定芽伸长、生根培养基的筛选。选取Cm CCD7和Cm CCD8基因的特异性片段,构建反向重复序列的RNAi植物表达载体。通过农杆菌介导的转化方法将这两个载体转化甜瓜植株。对获得的RNAi植株进行PCR和Southern杂交验证。对RNAi植株的IAA、ABA含量利用酶联免疫吸附(ELISA)进行测定,同时收集、浓缩、纯化甜瓜根系分泌物,用UPLC-MS/MS对5-deoxystrigol含量测定。最后对RNAi甜瓜植株的分枝情况、列当寄生数进行统计分析。选取休眠种子、预培养后的种子和GR24处理后的列当种子,提取RNA、构建测序文库进行RNA-seq测序。对获得的数据进行RT-PCR验证、筛选和统计;并对获得的Unigenes在NR、Swissprot、GO、COG、KOG和KEGG等数据库进行注释。对差异基因信息GO功能分析、KEGG代谢通路分析。对储存物质、核酸、蛋白质合成代谢相关基因进行了分析。最后,对激素合成代谢的相关基因进行了RT-PCR验证和分析,并对相应的激素水平进行了测定。结果甜瓜Cm CCD7和Cm CCD8基因的c DNA全长分别为2346 bp和2153 bp,分别包含了长度为1833 bp(KF381339.1)和1656 bp(KJ473491.1)的开放阅读框。Cm CCD7和Cm CCD8在甜瓜“黄旦子”的根、茎、叶、芽中均有表达,其中以根中的表达量最高,芽中最少。整体进行对比后,Cm CCD8基因的相对表达量都要高于Cm CCD7基因。Cm CCD7和Cm CCD8编码的蛋白质分子量分别为68.60 k D和61.24 k D。Cm CCD7和Cm CCD8蛋白与己知蛋白质RPE65的三级结构有较高的同源性。两天叶龄子叶为最佳外植体,分化率最高。而且,不定芽的分化主要发生在临近下胚轴子叶基部一侧的伤口边缘。6-BA与IAA浓度比值越大,越有利于不定芽的分化;6-BA浓度为1.2 mg/l时,诱导效率相对较高。在不含激素的MS培养基中外植体基部产生许多不定根。在不同浓度范围的Cef下,不定芽的诱导率并无显著差异,而且浓度500 mg/l的Cef对农杆菌生长抑制效果较好,因此,以500 mg/l为最佳浓度用于侵染后的脱菌和抑菌过程。在Kan浓度达到100 mg/l时,子叶不能诱导产生不定芽,故将Kan筛选压力定为100 mg/l。进行PCR和Southern杂交检测后,分别成功获得13和8转基因植株。挑取RNAi-Cm CCD7和RNAi-Cm CCD8单克隆植株各一株进行后续试验。RNAi植株的分枝数和IAA的水平与非转基因的植株的分枝数量和IAA水平都非常接近。ABA在非转基因和rnai-73植株中显著高于比rnai-84植株中。但是并没有检测到5-deoxystrigol,即使是在非转基因甜瓜中。无论是野生型还是RNAi植株列当寄生率都非常高,平均每株植株有100个列当寄生。但rnai-84植株上的列当寄生率比rnai-73和野生型植株的显著降低。转录组测序共得到19.79Gb Clean数据,各样品Q30碱基百分比均大于88.36%。在各核酸数据库中注释到53,921条Unigenes。经过RT-PCR验证后,对差异基因分析发现,其中休眠种子和预培养种子中的显著差异基因有694个,预培养种子和GR24处理后的种子中的显著差异表达基因有4,630个。对三个样品中的差异表达基因进行聚类分析,将这些差异表达基因划分到9个Cluster中。三个不同萌发阶段的差异基因参与了96个代谢通路。在预培养阶段有GA和BR合成的相关基因被激活,且两种激素的含量也同时升高,与基因表达情况一致。从转录组注释的数据中找到了3个与独脚金内酯信号接收相关的基因,MAX2和2个KAI2-like基因。分析后发现,萌发刺激物受体的相关基因已经在这个阶段得到表达。在GR24处理后,GA、ABA、乙烯和BRs合成代谢的许多相关基因也发生了显著变化,而且这些变化与其含量的变化一致。在不同激素处理试验中,发现氟啶酮这种类胡萝卜素合成抑制剂可以刺激列当种子的萌发,其可能是抑制了ABA的合成而起作用的。结论在甜瓜上克隆了与独脚金内酯合成的两个关键基因Cm CCD7和Cm CCD8,并通过RNAi的方法获得了相应的转基因植株,发现Cm CCD7和Cm CCD8对甜瓜抗列当的作用不是很明显。通过对列当种子萌发不同阶段转录组测序分析发现,预培养阶段对列当种子的主要作用可能是诱导GA的合成而不是激活独脚金内酯受体,GR24的作用可能主要是通过调节ABA的合成代谢来促使列当种子萌发。
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S453

【参考文献】

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本文编号：1286201