环形泰勒虫裂殖体转化细胞抑制性消减文库的构建及差异基因的鉴定

发布时间：2017-12-14 15:05

  本文关键词：环形泰勒虫裂殖体转化细胞抑制性消减文库的构建及差异基因的鉴定

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【摘要】：环形泰勒虫病(Tropical theileriasis)是由环形泰勒虫(Theileria annulata)寄生于牛淋巴细胞、巨噬细胞和红细胞内所引起的一种蜱传性血液原虫病。环形泰勒虫及同属的小泰勒虫(T.parva)是截至目前已发现的唯一一类可使哺乳动物细胞发生转化(永生化)的真核生物,而且这类细胞转化是可逆的,当转化细胞内的寄生虫被抗泰勒虫药物布帕伐醌(Buparvaquone,BW720c)清除后,转化细胞将恢复正常细胞的有限繁殖特性,进入凋亡程序。本研究利用抑制性消减杂交(SSH)技术构建环形泰勒虫裂殖体感染细胞与正常牛外周血单个核细胞(PBMCs)抑制性消减文库,并对部分差异基因进行生物信息学、实时荧光定量PCR和Western blot分析,最终筛选环形泰勒虫裂殖体基因及转化细胞与宿主正常细胞之间的差异表达基因,为深刻理解环形泰勒虫与宿主细胞相互作用的分子基础、揭示环形泰勒虫转化细胞的机制奠定基础。主要研究结果如下:1.成功构建了环形泰勒虫裂殖体转化细胞抑制性消减文库,通过文库序列测序,共获得364条有效ESTs序列,片段大小主要分布在350~1200bp之间;将所获ESTs进行BLASTn序列比对,最终获得192条基因序列,其中来自环形泰勒虫的序列60条(包括11条虫体蛋白酶基因序列、10条膜蛋白基因序列、7条假设蛋白基因序列、5条凋亡相关虫体蛋白基因序列、5条核糖体蛋白基因序列、4条细胞周期蛋白基因序列、4条虫体抗原基因序列和14条虫体其它基因序列)、牛基因序列131条(其中19条为肿瘤相关蛋白基因序列)和1条未知序列。2.通过对文库中环形泰勒虫裂殖体基因进行克隆测序,最终获得13条全长CDS序列;利用Protfun、Signa l P3.0、TMHMM 2.0和Lasergene(protean)生物信息学软件预测分析:Ta65、Ta129和Ta513蛋白存在较多的抗原表位,可用于后续诊断抗原或疫苗研制;Ta129、Ta511和Ta513可能具有信号转导和转运等功能,为后续研究奠定了基础。3.使用Primer Express 3.0软件设计18S r RNA、GAPDH、ACTB、PRKG1和TBP 5个牛内参基因的Real-time PCR引物,以环形泰勒虫裂殖体转化细胞和非感染牛PBMCs为试验材料,对引物特异性、标准曲线、扩增效率分析,并利用ge Norm和Norm Finder进行综合评价;结果发现,5个内参基因的扩增效率介于81.2~120.1%,且特异性均较好;18S r RNA和GAPDH具有良好的线性扩增;ge Norm和Norm Finder分析均发现18S r RNA为最稳定内参基因;综合以上结果,最终确定18S r RNA作为最稳定内参基因,可用于环形泰勒虫裂殖体转化细胞中信号通路的研究。4.对环形泰勒虫裂殖体转化细胞差异基因进行Real-time PCR分析;结果显示:宿主细胞肿瘤相关基因TFG、HCLS1和SENP5在转化细胞中的转录水平分别是非转化细胞的2.74、2.06和1.32倍;环形泰勒虫裂殖体蛋白基因Ta65(TA08105)和Ta129(TA20380)在环形泰勒虫裂殖体阶段的转录水平分别是裂殖子(红细胞内寄生阶段)阶段的2.10和2.08倍。5.利用BW720c作用环形泰勒虫转化细胞,杀死虫体,再利用Real-time PCR和Western blot方法检测宿主肿瘤相关基因的转录和表达情况。结果显示:相比对照组,在BW720c药物处理组中,宿主肿瘤相关基因HCLS1和TFG的转录水平明显下降;宿主肿瘤相关蛋白TFG在药物作用72h时,蛋白表达量有显著下降;综合以上结果说明,TFG蛋白在转化细胞中的表达量与环形泰勒虫的寄生直接相关;该试验结果为进一步研究环形泰勒虫与宿主细胞相互作用奠定了基础。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.7

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本文编号：1288328