紫黑翼蚌养殖基础生物学特性与钩介幼虫变态发育研究

发布时间：2017-12-14 15:14

  本文关键词：紫黑翼蚌养殖基础生物学特性与钩介幼虫变态发育研究

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【摘要】：淡水蚌类是指软体动物门、双壳纲、蚌目的种类,它们起源于大约1亿年前,在漫长的进化演变过程中形成了丰富的生态和物种多样性。目前,现存的淡水蚌类约840种,除南极地区外世界各个地区均有分布。它们不仅在维护淡水生态系统的稳定中发挥重要作用,而且自远古时代就为人们所利用,具有十分重要的经济价值,主要包括食用、工艺品和培育珍珠等。紫黑翼蚌(紫黑翼蚌(Potamilus alatus )原产于北美洲,隶属于蚌科、Lampsilinae亚科,为大型淡水贝类。在天然水域中紫黑翼蚌能产生天然的紫黑珍珠,人工插珠试验表明:紫黑翼蚌是培育优质紫黑珍珠的优良品种。为在我国发展紫黑珍珠养殖,2012年淡水渔业研究中心从美国引进一批紫黑翼蚌幼蚌,在国内开展人工驯养研究。由于紫黑翼蚌在北美为稳定物种,基础生物学研究甚为薄弱,且尚未有人工养殖,这给我国开展人工驯养带来极大困难。另一方面,紫黑翼蚌钩介幼虫需要寄生在特定的寄主鱼——淡水石首鱼(Aplodinotus grunnens)才能完成寄生变态发育,从而实现苗种的人工繁育。由于国内没有淡水石首鱼,严重制约了我国紫黑翼蚌苗种的人工繁育和紫黑珍珠产业化发展进程。本文以引进的紫黑翼蚌幼蚌开展养殖基础生物学特性与钩介幼虫变态发育研究,为实现紫黑翼蚌人工养殖与繁育提供理论依据和技术支撑,对我国淡水珍珠养殖品种结构调整和可持续发展具有重要价值和意义。本研究主要包括以下6个部分:1紫黑翼蚌在人工养殖条件下的生长与形态特征在ISC模式下,1 ～ 3龄紫黑翼蚌体重生长呈现明显周年季节变化特征,4～10月为快速生长期,11月～奕年3月为缓慢增长期,呈现明显的“快-慢”交替规律;在1～2龄阶段,壳长、壳高及壳宽生长趋势与体重相似,而2～3龄阶段均为平缓生长期;贝壳存在一定的异速生长,2龄壳宽增长率最高,3龄壳高增长率最高。Logistic模型为紫黑翼蚌壳长生长的最佳拟合模型。比较了两种养殖模式对紫黑翼蚌成活和生长的影响。在SPC模式下,15个月驯养成活率(98.6 ± 2.9% )显著高于ISC模式(85.0 ± 5.0% );自2龄起,SPC组蚌平均体重、壳长、壳高、壳宽及月增长率均显著高于ISC组;紫黑翼蚌驯养死亡主要出现在6～8月高温期间,可能是高水温与高氨氮及亚硝酸盐等协同作用结果;紫黑翼蚌适宜的生长水温为18.7 ～31.5℃C,且对低温有较强的适应能力。通过个体标记跟踪比较了紫黑翼蚌雌雄形态和生长差异,结果表明:两性异形和体重、壳长、壳高及壳宽差异均出现在2龄初次性成熟前后;雌蚌双壳后端逐步变宽直而膨胀,可能有利于育儿囊内胚胎的发育。在SPC模式下,2龄雄蚌体重、壳长分别高于雌蚌41.5%、16.7%,3龄雄蚌分别高44.0%、15.1%,雄蚌更适宜作为紫黑珍珠培育的受体蚌;两种养殖模式对雌雄形态分化影响不大,对雌雄体重和壳长生长差异表现时间无显著影响,但在ISC模式下雌雄壳高、壳宽出现差异的时间延迟。2紫黑翼蚌幼蚌足丝分泌特性与微结构研究与我国淡水蚌类不同,紫黑翼蚌在幼蚌早期生长阶段能分泌形成暂时性足丝。在壳长5 ～ 30mm阶段,随着壳长增长,分泌足丝的幼蚌比例逐步下降,而壳长30mm以上的幼蚌停止分泌。底质类型显著影响幼蚌足丝分泌,但足丝分泌速率存在明显的个体差异。对足丝微结构观察显示:足丝主要由足丝线、足丝柄及足丝盘组成。若干足丝盘通过足丝柄沿足丝线随机链接分布。足丝线外部由一层均质的足丝膜覆盖,内部由4股初级纤维形成右手螺旋结构,而初级纤维由大量平行排列的直径5μm的二级纤维组成。足丝盘底部具有较高的粘性,在水下可牢固粘附在砂砾等底质上。当受到外力拉伸后,足丝线可发生较大的弹性形变,但足丝膜先于内部纤维发生断裂。幼蚌的足丝与海水贻贝足丝的微结构和氨基酸组成均存在显著差异,其独特的结构在早期幼蚌的生存、迁移和聚集上具有重要作用。本研究首次报道了紫黑翼蚌的暂时性足丝分泌特性和微结构,并探讨了与生长发育的关系,为进一步开展早期幼蚌规模化培育提供重要理论依据。3人工养殖紫黑翼蚌的繁殖生物学研究在江苏地区紫黑翼蚌养殖种群在2龄达到初次性成熟,未发现明显的性别偏离。9月早期至10月份为雌雄蚌交配盛期,在10月初即可达到成熟,而自然排放主要在翌年4 ～ 5月份,为长期孵育类型(Bradytictic )。雌蚌性成熟最小壳长58.5 mm ,怀幼量在2860 ～ 37400 ,与养殖模式及母蚌的体重等密切相关,但显著少于我国常见的大型蚌类的怀幼量。在人工养殖条件下,紫黑翼蚌的繁殖周期与阿拉巴马州的野生种群相似,而与更高纬度的威斯康辛州野生种群有较大差异,这可能主要与生长发育的积温差异有关。紫黑翼蚌受精卵为长椭圆形,随着胚胎发育时序,卵黄囊逐步被胚体吸收而缩小,(?)胚体逐步增大,但胚体并不包裹卵黄囊吸收营养,这种特殊的营养供给方式与我国的蚌类完全不同。依据卵黄囊的大小、胚体形态及运动等显著发育特征,将原先统称为钩介幼虫期进一步划分为肌肉效应期、闭壳肌形成期、双壳成形期、双壳开合期及破膜期。形态学观察表明:成熟钩介幼虫为斧头型,双壳左右对称,但大小略有差异;腹缘具有2对胶质的壳钩和成排的乳突,在幼虫寄生过程中具有重要作用;外套膜游离面为柱状细胞,内部具有3对左右对称分布的感觉毛,1对位于近腹缘,2对分别位于闭壳肌附近。4紫黑翼蚌母系与父系线粒体基因组比较及系统发育分析基因扩增表明:紫黑翼蚌体内存在两类完全不同线粒体,为明显的单双亲遗传(DUI )。母系(F型)线粒体基因组长度为16 067bp ,父系(M型)为16 560bp,比F型长493bp。两类线粒体均含有37个常规基因。在F型和M型线粒体中分别发现1个雌性开放阅读框(forf)和雄性开放阅读框(morf);基因组均具有明显的(A+T )碱基偏向(F = 61% , M = 62.2% )。 37个基因排序差异主要是tRNAs与两个ORFan基因的位置存在较大不同。M型线粒体基因具有144 bp的cox2延长(cox2e ),显著短于已报道的蚌类531～～576bp差异,这种较短的Mcox2e可能是Potamilus属物种线粒体基因组的共同进化特征。以23个蚌类线粒体基因组序列(包括紫黑翼蚌)重建了其系统发育树,结果表明:蚌类F型和M型为并系,进化关系显示:DUI起源先于蚌科的物种形成之前,也先于蚌科和珠蚌科物种分化;紫黑翼蚌与Leptodealeptodon的亲缘关系更为接近,这与两者具有十分相似的生物学特性相吻合。已有近缘种的生物学研究也对我国紫黑翼蚌的人工养殖和繁育具有重要参考价值。5紫黑翼蚌钩介幼虫寄主鱼的人工筛选选取16种代表性鱼类对紫黑翼蚌钩介幼虫寄主鱼进行人工筛选试验结果表明:仅在淡水石首鱼上获得变态发育的稚蚌,寄生变态率为49.6% ,过量寄生可能是导致淡水石首鱼死亡的重要原因。扫描电镜观察显示:钩介幼虫可在眼斑拟石首鱼鳃丝寄生并形成完整的包囊,且在大规格鱼体形成包囊的速度明显快于幼鱼,表明眼斑拟石首鱼具有用作替代寄主鱼的潜力;但在寄生和淡水低渗双重胁迫下,眼斑拟石首鱼寄生后出现极高的死亡率,应进一步开展淡化处理和营养强化培育,提高其寄生鱼的暂养成活率。与其他鱼类相比,在黄颡鱼、小口鲈鱼、蓝鲶鱼寄生后1～2d内脱落的幼虫几乎全部死亡,推测3种鱼体中可能存在紫黑翼蚌幼虫的致死因子,这与后期的黄颡鱼血浆对幼虫的体外培养试验结果相符。综合结果表明:紫黑翼蚌是目前发现对寄主鱼选择性最为专一的蚌类。6紫黑翼蚌钩介幼虫的非寄生变态发育研究比较了改进的体外培养技术和传统方法对紫黑翼蚌钩介幼虫非寄生变态发育的影响。进一步以改进的体外培养技术,从14种血浆(或血清)中筛选出了紫黑翼蚌钩介幼虫体外培养高效配方,首次成功实现斧头型钩介幼虫的非寄生变态发育。结果表明:添加不同血浆(血清)对紫黑翼蚌的钩介幼虫变态发育具有显著差异,黄颡鱼、大口黑鲈、大鳞渻、杂交鲟及兔血清组幼虫全部死亡,而其他9组幼虫培养20d的成活率在12.4% ～ 98.3%之间,仅瓜子斑和眼斑拟石首鱼组能使幼虫完成变态发育,瓜子斑组幼虫变态率最高(93.3 ± 3.1% ),显著高于海水与淡化眼斑拟石首鱼组。不同孕育时期的孕育蚌幼虫变态率存在显著差异,变态率所孵育时间增加而逐步下降,可能与孕育蚌的营养供给有关。2倍传统混合抗生素浓度对幼虫变态发育具有明显抑制和致死作用,表明紫黑翼蚌对混合抗生素较为敏感。添加不同比例瓜子斑和鲤鱼混合血浆对幼虫变态发育具有明显差异:随着鲤鱼血浆添加比例增加,幼虫变态率、稚蚌活力显著下降,而外壳生长速度和稚蚌畸形发育比例明显增加;保存11月与新制备的瓜子斑血浆对幼虫变态率无显著差异,但前者变态畸形率显著升高(P=0.003) 其畸形稚蚌与鲤鱼组相似。表明鲤鱼血浆中存在促进幼虫外壳生长的重要营养因子,而缺乏促进幼虫内脏发育的关键营养因子;瓜子斑血浆中存在较高含量促进幼虫内脏包括斧足发育的关键营养因子,且随着冻存时间会明显下降。在添加瓜子斑血浆的培养液中,24℃条件下,幼虫在20d完成变态发育成稚蚌。在变态发育过程中,不仅要完成内脏组织器官的分化,其外壳增长约2～3倍,为内脏器官的分化与生长提供了更大的空间。在培养早期,幼虫外套膜细胞逐步增厚形成蘑菇体细胞,使双壳封闭;新壳从前后端逐步生长成近圆形;在培养中期至后期,内部斧足板、鳃板、内脏组织及闭壳肌等逐步形成,最终变态形成依靠斧足自由爬动的稚蚌。对血浆主要生化指标测定分析表明:与其他鱼类相比,瓜子斑血浆具有低血糖和甘油三酯、高蛋白、胆固醇和脂蛋白的特点,可能是幼虫具有高变态率的重要原因。进一步对FAA比较测定分析表明:常见20种氨基酸虽有一定差异,但与L-15基础培养液相比,其含量极低,对培养液配方中含量无显著影响。鲤鱼血浆的牛磺酸含量显著高于其他3种鱼类,分别是瓜子斑的9.1倍、眼斑拟石首鱼的3.6倍。高浓度的牛磺酸是唯一可能促进幼虫外壳快速生长的氨基酸因子。对血浆脂肪酸组成比较分析推测:培养液中缺乏足够量的DPA和DHA可能是紫黑翼蚌幼虫斧足及内脏异常发育的重要原因之一。黄颡鱼、大鳞渻血浆热灭活处理后对幼虫变态发育具有明显影响。未灭活组幼虫在培养24h全部开口腐烂死亡,而黄颡鱼、大鳞渻血浆灭活组幼虫在培养10d存活率分别为82%、55% ,且黄颡鱼浆灭活组外壳生长明显,而大鳞渻组幼虫外壳生长差异较大。对比黄颡鱼、大鳞渻、瓜子斑及眼斑拟石首鱼血浆灭活前后的8种非特异性免疫指标变化,结果表明血浆中溶菌酶、干扰素、补体C3、C4、IgG、IgM、α-HBDH及ALP并非是幼虫的致死因子。这种紫黑翼蚌幼虫致死因子可能普遍存在鱼体中,可能是鱼类对蚌类钩介幼虫寄生的第一道天然防御屏障。
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4
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本文编号：1288364