LPS刺激的奶牛乳腺上皮细胞转录组和miRNA表达谱变化规律的研究

发布时间：2017-12-14 19:37

  本文关键词：LPS刺激的奶牛乳腺上皮细胞转录组和miRNA表达谱变化规律的研究

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【摘要】：奶牛乳房炎是一种严重影响奶牛业生产效益的疾病,革兰氏阴性细菌是引起奶牛乳房炎的病原菌之一,乳腺作为病原的直接入侵部位,占乳腺组成70%的乳腺上皮细胞则在抵御病原入侵时,发挥重要的免疫防护作用。为了揭示临床型乳房炎过程中奶牛乳腺上皮细胞免疫机制的动态变化过程。本研究通过革兰氏阴性细菌内毒素脂多糖(LPS)刺激牛乳腺上皮细胞,通过转录测序和小RNA测序技术获得LPS刺激的0,4,8,12h牛乳腺上皮细胞中mRNA和miRNA表达谱,并且采用microRNA茎环结构QT-PCR法和基因QT-PCR法,对测序结果中与免疫相关的分子在LPS刺激的牛乳腺上皮细胞和健康/患乳房炎牛的乳腺组织中,进行定量表达分析。并对健康和患乳房炎奶牛乳腺组织样品中的相关基因也进行了表达谱分。最后,本文对相关基因的单核苷酸多态性与中国荷斯坦奶牛生产性状和体细胞评分(SCS)进行了关联分析。通过以上研究,得出以下结果:(1)miRNA和mRNA表达谱本研究中0h,4h,8h和12h样本中总的mRNA表达量分别为797968,785310,776069,740583和总miRNA表达量分别为6500331,7487961,7179674,7518120,mRNA总的表达量变化趋势是下降的,而miRNA是上升的。通过对显著性差异表达的mRNA和miRNA进行GO功能和KEGG通路富集性分析,免疫应答通路显著富集在4h LPS刺激的牛乳腺细胞,而8,12h细胞没有。(2)LPS刺激后的牛乳腺上皮细胞中关键的信号通路和炎症应答分子炎症应答相关的信号通路,包括RIG-I样受体信号通路,NOD样受体信号通路,MAPK信号通路基因显著富集在LPS刺激的牛乳腺上皮细胞。因此显著富集在这些通路的42个mRNA和47个miRNA是牛乳腺上皮细胞在革兰氏阴性细菌LPS刺激时的重要炎症调节分子。(3)bta-miR-21-5p_R-1和bta-miR-27b在LPS刺激的乳腺上皮细胞中呈现高表达已有研究表明,在E.coli感染的MAC-T细胞呈现高表达;LPS刺激的牛乳腺上皮细胞中,bta-miR-21-5p_R-1和bta-miR-27b也呈现高表达。我们推测bta-miR-21-5p_R-1和bta-miR-27b可能在革兰氏阴性细菌感染的牛乳腺上皮细胞中发挥重要的作用。(4)microRNA靶基因的偏好性分析在LPS刺激的牛乳腺上皮细胞和患病的乳腺组织中,同一有靶向关系的m RNA-mi RNA对的表达量变化,并不都呈现相反的动态变化趋势。我们推测,在不同的生理或病理状态下,miRNA呈现靶标基因的偏好性(priority target mRNA)。(5)I型干扰素通路(Type I interferon)在LPS刺激的牛乳腺上皮细胞中被激活在LPS刺激的牛乳腺上皮细胞中,I型干扰素通路基因的正调节因子显著性增多,而在乳房炎乳腺组织,这些基因的表达量相对于健康组织显著降低。(6)NF-κB通路在乳房炎组织处于动态激活状态在奶牛乳房炎过程中,NF-κB通路处于激活状态,而且通过不断促进抑制子IκB的转录来补充胞质中不断降解的IκB蛋白,来维持NF-κB通路炎症免疫作用的动态平衡。TLR4在LPS处理的牛乳腺上皮细胞中表达量增加,而且在患病乳腺组织中的表达量也显著高于健康牛,因此推测TLR4是牛乳腺上皮细胞面对LPS作用时的受体分子。(7)揭示NF-κB通路的SNP位点与中国荷斯坦奶牛性状显著关联,可作为高产与抗乳房炎奶牛育种的DNA标记来进行MAS(Marker Assited Selection)。对于NF-κB通路基因上的SNP位点,SNV1-T是产奶性状和抗乳房炎优势等位基因;SNV2-A等位基因是乳房炎抗性优势基因;基因型SNV3-TC是高乳脂率优势基因型;SNV4-T是高乳脂率和抗乳房炎优势等位基因;基因型SNV7-AG是高乳蛋白优势基因型;SNV10-T和SNV14-C是高乳蛋白含量优势等位基因;基因型SNV13-TT个体是抗乳房炎个体。这些位点可以作为今后高产和抗乳房炎奶牛育种的标记分子位点来进行辅助育种。综合以上结果,LPS刺激会引起乳腺上皮细胞的快速免疫应答反应,在4h LPS刺激的细胞反应最活跃,而且RIG-I样受体信号通路(RIG-I-like receptor signaling pathway),NOD样受体信号通路(NOD-like receptor signaling pathway),MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)可能是奶牛乳房炎最活跃的免疫应答通路。NF-κB通路在乳房炎的乳腺上皮细胞中处于抑制状态,而在乳房炎的乳腺组织中处于激活状态。在奶牛乳房炎过程中,mi RNA和mRNA的互作呈现复杂的网络关系,他们将多个信号通路联系在一起,共同调节奶牛机体的炎症应答过程。在NF-κB通路基因获得的SNP位点,可以作为奶牛育种的辅助标记分子。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S823
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本文编号：1289123