马精子保存技术及精子冻融损伤机制的研究

发布时间：2017-12-15 19:31

  本文关键词：马精子保存技术及精子冻融损伤机制的研究

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【摘要】：马作为一种主要的大家畜,曾经与人类生产生活息息相关,机械工业兴起后,马的役用价值弱化,逐渐淡出人们生活。近些年,随着我国人民生活水平的提高,以产品、文化休闲为主的现代马业在我国悄然兴起,现代马业的发展迫切需要采用人工授精的方式进行马匹改良,精液的体外保存是目前我国马匹人工授精推广应用过程中的技术瓶颈,本研究针对这一问题,开展了马精液低温和冷冻保存技术的研究。并在此基础上应用同位素标记定量技术(i TRAQ)探索马精液冻融后受胎率低的原因及精子冻融损伤机制。取得结果如下:(1)分别以INRA82和INRA96?作为基础稀释液,比较6.5、6.7、6.9、7.1、7.3和7.5 p H下保存精液1、24、48和72h后对精液活力的影响,结果表明马精子体外存活的适宜p H为6.9-7.3之间。当p H低于6.7或高于7.3时对精液体外保存不利。用同样方法研究公马个体间是否存在适宜p H差异,结果表明4匹公马精液体外存活的适宜p H均为6.9-7.3。(2)不同平衡时间、冷冻方法及解冻程序对精液冷冻效果的研究表明,精液冷冻前平衡120 min、180 min和240 min三组精液冻融后活力、质膜完整性显著高于0、45、90 min及过夜平衡组(P0.05);距离液氮面高度2cm和4cm熏蒸法获得的冷冻效果与程序冷冻仪相当;采用高温快速解冻法(75℃,7s和46℃,20s)比常规方法(37℃,30s)可获得更高的冻后精液活力。(3)不同精清浓度对精液低温及冷冻效果影响研究表明,30%和40%精清浓度组精液保存后精液活力显著低于0%、10%和20%精清浓度组(P0.05),10%精清浓度组精液保存24 h后活精子比例显著高于0%和20%精清浓度组(P0.05),但保存至96 h后精液活精子比例显著低于0%精清浓度组(P0.05);不同浓度精清对精液冷冻效果的影响表明,含0%浓度精清组精子冻融效果最好,随着精清浓度的增加冻融后精液活力、质膜完整性、高线粒体膜电势率逐步递减(P0.05)。(4)比较5种抗冻剂,包括甘油、乙二醇、二甲基亚砜、甲基甲酰胺、二甲基甲酰胺及抗冻剂组合对马精液冷冻效果的影响。结果表明3.5%浓度的甘油和2.5%、3.5%及5%甲基甲酰胺和二甲基甲酰胺冻后精液活力显著高于2.5%浓度的甘油和2.5%、3.5%及5%乙二醇和二甲基亚砜(P0.05);比较甘油、甲基甲酰胺和二甲基甲酰胺三种抗冻剂不同组合对马精液冷冻效果的影响,结果表明甘油和甲基甲酰胺两种抗冻剂组合能显著的提高冷冻效果(P0.05)。(5)比较添加不同浓度的卵黄成分(全卵黄、卵黄浆蛋白、LDL及卵黄可溶性蛋白)、大豆卵磷脂及β-环糊精胆固醇对马精液冷冻效果的影响。结果表明卵黄浆蛋白、LDL及卵黄可溶性蛋白三种卵黄组分均对精液冷冻保护有显著作用,但不同卵黄组分间效果无显著差异;添加低浓度(1%)的大豆卵磷脂精液冻融后活力与对照组(4%全卵黄组)无显著差异(P0.05),但添加高浓度大豆卵磷脂(2%和4%)组冻融后精液活精子比例、前向运动精子比例均显著低于对照组(P0.05);添加不同浓度的β环糊精胆固醇组解冻后精液活力与对照组相比无显著差异(P0.05)。(6)比较单独或组合添加葡萄糖、果糖、乳糖、棉籽糖及海藻糖对马精液低温保存和冷冻效果的影响。结果表明:单独添加乳糖和棉籽糖低温保存24 h后精液活精子比例和前向运动精子比例显著低于单独葡萄糖、果糖及海藻糖组(P0.05),葡萄糖、果糖及海藻糖组间无显著差异;葡萄糖和乳糖分别与其他几种糖两两组合低温保存1、24、48、72、96 h后精液质量无显著差异;单独添加棉籽糖精液冻融后活精子比例和前向运动精子比例显著低于果糖和海藻组(P0.05),但精液质膜完整性和线粒体膜电势却显著高于其他各组(P0.05);单独添加葡萄糖、果糖、海藻糖及乳糖精液冻融后活精子比例、前向运动精子比例及线粒体膜电势均无显著差异(P0.05),添加果糖组冻融后精液质膜完整性显著低于葡糖组(P0.05);不同糖组合精液冻融后,乳糖+葡萄糖+海藻糖组精液质膜完整性显著高于乳糖+果糖、乳糖+海藻糖、乳糖+葡萄糖+果糖和乳糖+海藻糖+果糖组(P0.05),乳糖+果糖组精液质膜完整性显著低于除乳糖+海藻组外的其他各组(P0.05)。乳糖+葡萄糖+果糖组精液线粒体膜电势显著高于乳糖+果糖组(P0.05),与其他各组间无显著差异。(7)探索用酪蛋白酸钠和乳清粉替代天然奶成分配置马精液保存稀释液的可行性。结果表明两种基础稀释液同时添加乳清粉和酪蛋白酸钠低温保存48h后精液活力均显著高于对照组(P0.05),表明乳清粉和酪蛋白酸钠对对精液低温保存有效;在去除天然奶成分的INRA82基础液中添加0.1g/m L浓度的乳清粉和0.4g/m L的酪蛋白酸钠可获得最佳的精液保存效果;精液冷冻实验证实用乳清粉和酪蛋白酸替代INRA82稀释液中的奶成分添加卵黄和抗冻剂后配置的冷冻液获得了比商品液更好的冷冻效果。(8)分别比较了谷氨酰胺、甘氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、牛磺酸、维生素C、维生素E、褪黑素8种抗氧化对马精液低温和冷冻保存效果的影响,结果表明添加25m M牛磺酸显著改善了精液低温保存后精液活力;添加Ve和甲硫氨酸组精子冻后线粒体完整性显著高于对照组,添加甲硫氨酸和甘氨酸组精子冻后质膜完整性有高于对照组的趋势(P=0.055),相反添加2.5m M半胱氨酸则不利于精液低温或冷冻保存。(9)比较添加不同浓度(0.1、1、10、100μg/m L)准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白对马精液冷冻效果的影响。结果表明,添加1μg/m L浓度昆虫抗冻蛋白显著改善了冻融后马精液活力和质膜完整性,但添加更高浓度100μg/m L的抗冻蛋白则对马精液冷冻有害。(10)采用自制稀释液进行精液低温保存或冷冻后受胎验证并进行大群推广验证。结果表明用自制液低温保存精液配种后情期受胎率为67.4%,进口INRA96?稀释液配种后情期受胎率为57.7%,两者无显著差异。自制冷冻稀释精液冻后活力在0.3以上,情期受胎率达到了50%,能够满足生产需要。低温保存稀释液推广应用601匹马,情期受胎率达到了63.39%。(11)利用同位素标记定量技术(isobaric tags for relative and absolute quantization,i TRAQ)检测精子冻融前后蛋白表达差异,并对差异蛋白进行生物信息学分析,揭示精子冻融损伤机制。每组样本设置两个重复样本,质谱分析后得到的数据用Mascot 2.2软件在Uniprot_equuscaballus_28004数据库中进行数据搜索。共鉴定到2073个蛋白,以变化倍率±1.5倍,P0.01为标准筛选差异蛋白,3个比较组分别筛选出了112(冻精/鲜精)、90(半衰冻精/冻精)和128(半衰冻精/鲜精)个差异蛋白。
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S821
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本文编号：1293169