猪圆环病毒2型感染诱导PK-15细胞内质网应激与凋亡的机制研究

发布时间：2017-12-15 19:38

  本文关键词：猪圆环病毒2型感染诱导PK-15细胞内质网应激与凋亡的机制研究

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【摘要】：猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV2)是引起猪圆环病毒相关疾病(porcine circo virus-associated disease,PCVAD)的主要病原。PCV2属于圆环病毒科,圆环病毒属,其基因组是大小约为1.7 kb的单股共价闭合环状DNA,包含三个主要的开放阅读框(open reading frames, ORFs),分别编码病毒复制相关蛋白(ORF1)、衣壳蛋白(ORF2)和凋亡相关蛋白(ORF3)。PCV2是已知感染哺乳动物的最小的病毒。病毒主要在淋巴组织中复制,造成淋巴组织消失和组织细胞浸润,最终导致猪的免疫抑制。免疫刺激或者与其他病原共同感染能加重疾病的发生。有关PCV2致病机理的研究已有较大进展,但仍有一些重要的机制有待阐明。细胞凋亡(apoptosis)可能是PCV2感染造成淋巴组织消失的机制之一。但是凋亡究竟是病毒蛋白如ORF3或衣壳蛋白(Cap)直接导致,还是通过自噬(autophagy)或未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)间接导致并不明确。UPR、自噬和凋亡在细胞长期处于应激状态下能通过相似的信号通路连续发生,并最终决定细胞的命运。内质网(endoplasmic reticulum, ER)在病毒的复制和成熟中起重要作用。病毒通过挟持细胞的翻译机制在内质网腔合成大量病毒蛋白或利用内质网作为复制场所,最终导致内质网应激(ER stress)。细胞通过诱导UPR来应对应激,或通过凋亡来结束不能缓解的应激。能引起内质网应激的病毒多为RNA病毒,PCV2能否诱导内质网应激未有报道,我们推测PCV2诱导的凋亡可能与内质网应激有关。本研究旨在探明：(1)PCV2感染能否引起UPR,以及引起UPR的关键病毒蛋白；(2)UPR对病毒复制的影响；(3)PCV2引起细胞UPR与凋亡之间的联系。1.PCV2感染细胞能选择性激活UPR的PERK/eIF2a/ATF4/CHOP通路通过免疫印迹和RT-PCR检测内质网应激标志分子GRP78和UPR三条分支PERK/eIF2α、TF6和IRE1α/XBP1,我们发现PCV2感染PK-15细胞和猪肺泡巨噬细胞均能上调GRP78,并选择性激活PERK通路,ATF6和IRE1α/XBP1通路均不激活。促进细胞存活的转录因子ATF4和促进凋亡的CHOP蛋白在PCV2感染36-48 h后上调,同时伴随大量病毒蛋白的产生。因此我们推测持续的PCV2感染能够激活PERK/eIF2a/ATF4/CHOP信号通路。利用表达病毒编码蛋白的真核载体转染细胞,免疫印迹结果表明,PCV2 Rep和Cap蛋白能诱导UPR的PERK通路。2.PCV2能够利用PERK通路和分子伴侣GRP78增强其复制利用PERK通路关键分子的抑制剂或RNA干扰研究UPR对Cap蛋白表达和PCV2复制的影响。免疫印迹和TCID50结果表明,抑制PERK磷酸化或抑制eIF2a去磷酸化能够显著减少PCV2的复制(TCID50:GSK2606414:4.58 vs 2.88, P0.01; siPERK:4.53 vs 2.75, P0.01; Salubrinal:4.49 vs 2.25, P0.01),表明PCV2可能利用PERK通路帮助其复制。通过真核表达载体或药物诱导过表达GRP78或用化学分子伴侣牛磺熊去氧胆酸处理能够增强PCV2的复制(TCIDso：pcDNA3-GRP78:4.03 vs 5.13, P0.05; BIX:4.13 vs 5.12, P0.05; thapsigargin:2.90 vs 3.67, P0.05; TUDCA:4.20 vs 4.90, P0.05),而基因沉默GRP78则显著降低Cap蛋白的表达和PCV2的复制(TCIDso:siGRP78:4.29 vs 2.96, P0.05)。表明内源性或外源性的伴侣分子可能帮助病毒蛋白正确折叠并促进病毒的复制。3.PCV2通过PERK/CHOP/Bcl-2通路引起细胞凋亡由内质网应激引起凋亡被认为是一些病毒的致病机理,如乙肝病毒感染；PCV2通过ORF3诱导凋亡尚有争论。我们通过免疫印迹检测凋亡关键分子,发现PCV2感染PK-15细胞后Bcl-2家族的抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL明显下调,caspase-3发生剪切；流式细胞术和TUNEL法检测凋亡也印证了PCV2感染能够引起早期凋亡和DNA断裂。通过化学分子伴侣缓解内质网应激能够减少PCV2诱导的CHOP表达和caspase-3剪切,表明内质网应激和凋亡之间存在联系。内质网应激造成感受器PERK的激活以及钙离子外流可以介导内源性线粒体途径的凋亡,信号通路最终汇集至线粒体,并激活凋亡执行者caspase-3。之前已证实PCV2感染选择性激活UPR的PERK途径以及诱导Ca2+通过内质网上的IP3R受体外流至细胞质,通过化学抑制剂或RNA干扰,我们发现抑制PERK或IP3R能够减轻PCV2感染诱导的凋亡。PERK下游的促凋亡分子CHOP可以通过抑制Bcl-2诱导凋亡,通过基因沉默CHOP能部分回补Bcl-2水平,说明PCV2感染可能通过PERK/eIF2a/CHOP/Bcl-2途径引起凋亡。为进一步探明诱导凋亡的关键病毒蛋白,我们利用病毒编码蛋白真核表达载体转染细胞,结果表明Cap能够通过PERK/eIF2α/CHOP通路诱导Bcl-2下调和caspase-3剪切,说明Cap蛋白在PCV2感染诱导UPR,继而引起凋亡中起关键作用。综上所述,本研究阐明了PCV2感染能够诱导UPR,并通过PERK/eIF2α/ATF4/CHOP/Bcl-2通路和钙离子外流诱导细胞凋亡,Cap是PCV2诱导细胞UPR和凋亡的功能蛋白。PCV2能利用PERK通路和GRP78增强其复制,说明PCV2感染早期通过调节UPR利于其在细胞内的增殖。研究结果为深入探究PCV2致病机制和探寻抗病毒药物筛选靶点奠定了基础。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.651

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本文编号：1293199