日本沼虾雌性性早熟相关基因的筛

发布时间：2017-12-16 08:05

  本文关键词：日本沼虾雌性性早熟相关基因的筛选、克隆、表达与功能分析

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【摘要】：日本沼虾是一种具有很高经济价值的十足目甲壳动物,是我国淡水养殖的主要种类之一。近年来,由于日本沼虾自然资源的锐减,其养殖规模不断扩大,但养殖的日本沼虾却出现了生产性能下降、种质资源不断退化的情况,最为严重的是出现性早熟现象。性早熟是指日本沼虾提前进入繁殖期,当其尚未达到商品规格大小时,性腺就已经发育成熟,同时个体生长停止,使虾的商品率降低、产品贬值。性早熟的雌性个体还会产生低质量的后代,这样年复一年的繁育,加重了日本沼虾种质资源退化现象,制约了日本沼虾养殖业的健康发展。因此对雌性日本沼虾的性早熟现象进行研究,对性早熟相关基因进行筛选和功能分析,对阐明日本沼虾性早熟的分子机制,解决日本沼虾种质资源退化问题具有重要的意义。本研究采用转录组测序的方法,通过差异表达分析鉴别出了性早熟的和正常性成熟的日本沼虾卵巢中的差异基因(DEGs),通过对这些DEGs的注释、表达模式聚类分析,以及显著富集性分析筛选出可能与日本沼虾性早熟相关的基因;利用基因克隆和cDNA末端快速扩增(RACE)PCR技术获得了其中5个可能与日本沼虾性早熟相关的基因的全长cDNA序列,并对其序列进行了生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR(QPCR)技术检测了这5个基因的mRNA的表达规律并利用RNA干扰(RNAi)技术沉默其表达,探索了这5个基因在日本沼虾卵巢发育过程中的作用,获得的主要研究成果如下:1.正常性成熟的和性早熟的日本沼虾卵巢转录组测序本次转录组测序从正常性成熟的和性早熟的日本沼虾的卵巢中共获得63,336个unigenes以及大量的繁殖相关unigenes和代谢通路。鉴别出了26,008个SSRs,并分别从正常性成熟和性早熟的日本沼虾卵巢转录组中预测了80,516个和80,529个SNPs,还预测出了29,851个性早熟和正常性成熟的日本沼虾卵巢转录组中之间的SNPs。首次从性早熟和正常性成熟的日本沼虾的卵巢中鉴别出了549个DEGs,包括212个上调基因和337个下调基因。另外,从这549个DEGs中鉴别出了187个正常性成熟的日本沼虾的卵巢中特异表达的DEGs和90个性早熟的日本沼虾的卵巢中特异表达的DEGs。通过对这549个DEGs的GO分类分析、KEGG通路分析、以及GO和KEGG显著富集性分析,鉴别出12个可能与日本沼虾性早熟相关的DEGs,即卵黄蛋白原(Vg)、组织蛋白酶L(CTSL)、半胱氨酸蛋白酶抑制因子(CST)、胰岛素样受体(INSR)、胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)、环氧化酶(COX)、谷胱甘肽过氧化物酶(gpx)、铜锌超氧化物过氧化物酶(sod1)、脂肪酸合成酶(fasn)、二磷酸核苷激酶(nm23)、核糖体蛋白l24(rpl24)和核糖核苷还原酶调节因子1(rrm1)基因。2.性早熟相关基因的克隆及序列分析克隆出了日本沼虾mnnm23、mnrpl24、mncox、mncst和mnrrm1基因全长cdna序列,这5个基因的cdna全长分别是829bp、564bp、3238bp、6199bp和2941bp,其orf区分别为531bp、486bp、1845bp、2709bp和2436bp,分别编码177、162、615、903和812个氨基酸。通过对这5个基因的生物信息学分析,发现mnnm23蛋白具有保守的ndk结构域及ndk活性部位基序(nxxh[g/a]sd),与罗氏沼虾的nm23(mrnm23)蛋白的氨基酸序列相似性最高;mnrpl24蛋白具有一个保守的trash结构域,20个磷酸化位点和两个典型的核定位信号,不具有线粒体类型的rpl24蛋白所具有的标签序列,是一种细胞质类型的核糖体蛋白;mncox具有一个明显的egf-like结构域、一个跨膜螺旋结构域和8个保守的对环氧化酶活性起重要作用的氨基酸残基,其mrna的3’端非编码区(3’utr)序列具有多个au富集元件(au-richelements,ares),其结构和功能应与脊椎动物的cox2最为接近;mncst氨基酸序列中含有6个cystatin-like结构域,是一种multicystatin蛋白;mnrrm1具有第i类rr酶的大亚基所具有保守的酶活性位点,大小亚基聚合所必须的两个α-螺旋结构域,因此mnrrm1属于第i类rr酶的大亚基。3.性早熟相关基因mrna的表达分析在日本沼虾的受精卵、无节幼体、蚤状幼体、糠虾幼体、仔虾及成虾这6个生长阶段中,mnnm23、mnrpl24、mncox、mncst和mnrrm1基因均在受精卵中的表达量较低;在日本沼虾的Ⅰ-Ⅵ期的卵巢中,mnnm23、mnrpl24、mncox和mnrrm1基因的表达量均在Ⅰ期卵巢中最高,而mncst基因在Ⅳ期卵巢中的表达量最高;在日本沼虾的卵巢、肝胰腺、肌肉、心脏、肠、鳃、胃、腹神经节和眼柄这9个组织中,mnnm23基因在日本沼虾肝胰腺和肌肉中的表达量最高,mnrpl24和mncst基因在日本沼虾肠中的表达量最高,mncox和mnrrm1基因在日本沼虾鳃中的表达量最高;这5个基因在性早熟的和正常性成熟的日本沼虾的卵巢中的表达量均有显著差异(p0.05)。4.性早熟相关基因的功能验证mnnm23基因沉默后,日本沼虾卵巢中卵黄生成作用标志基因vg和vgr,卵母细胞成熟标志基因cyclinb和cdc2基因的表达水平和虾的gsi在一个卵巢发育周期中与对照组相比提前达到峰值。mnrpl24、mncox和mnrrm1基因沉默后vg、vgr、cyclinb和cdc2基因的表达水平和虾的gsi在一个卵巢发育周期中与对照组相比在多个时间点都显著下降(p0.05)。mncst基因沉默后,日本沼虾卵巢中ctsl基因在一个卵巢发育周期的多个时间点与对照组相比显著下降(p0.05),而vg、vgr、Cyclin B和Cdc2基因的表达水平和虾的GSI在一个卵巢发育周期中与对照组相比没有显著差异(P0.05)。卵巢组织学观察发现MnNM23基因沉默后日本沼虾的卵母细胞的发育加快,MnRPL24、MnCOX和MnRRM1基因沉默后日本沼虾的卵母细胞的发育被延迟,而MnCST基因沉默后日本沼虾的卵母细胞的发育不受影响。因此,MnNM23对日本沼虾卵黄生成和卵母细胞的成熟具有负相关的作用,MnNM23基因的低表达会促进卵巢的快速发育。MnRPL24、MnCOX和MnRRM1对日本沼虾的卵黄生成和卵母细胞的成熟的具有正相关的作用,MnRPL24、MnCOX和MnRRM1基因的低表达会延迟卵巢的发育。而MnCST对卵黄生成和卵母细胞的成熟没有影响,因而对卵巢的发育也没有影响。卵巢发育过程中,尤其是在卵巢发育早期阶段,MnNM23的不足,或者是MnRPL24、MnCOX和MnRRM1的过量都有可能是导致日本沼虾性早熟的一个重要的原因,但确切的分子机制还需要进一步的深入研究。综上所述,本研究鉴别出了性早熟的和正常性成熟的日本沼虾卵巢的差异表达基因,并筛选出了可能的日本沼虾性早熟相关基因。对5个可能的日本沼虾性早熟相关基因进行了克隆、序列分析和mRNA的表达分析。最后探索了这5个基因在日本沼虾卵巢发育过程中的作用。本研究结果将为阐明日本沼虾性早熟的分子机制奠定基础。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S917.4
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本文编号：1295275