中华绒螯蟹血细胞免疫效应因子的抗菌功能研究

发布时间：2017-12-16 08:15

  本文关键词：中华绒螯蟹血细胞免疫效应因子的抗菌功能研究

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【摘要】：中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)属于节肢动物门(Arthropoda)、甲壳动物亚门(Crustacea)、十足目(Decapoda)、是我国东部沿海湖泊河流流域的重要经济物种,并得到广泛养殖。近年来,随着养殖规模的不断扩大和养殖密度的提高,各种由细菌、真菌、螺原体或不明原因所引起的疾病不断出现,对当地养殖者造成了巨大的经济损失,在我国蟹类养殖品种中病害最为严重。对于中华绒螯蟹免疫系统和免疫防御机制的理解是提高其抗病能力和研发药物的基础,因此,对该物种固有免疫机制的研究刻不容缓。为了保护自身不受外来物体的侵袭,生物体发展出了强大的免疫系统,并可分为适应性免疫(adaptive immunity)和固有免疫(innate immunity)。截止目前的证据表明,适应性免疫系统仅存在于脊椎动物中,而固有免疫系统则在无脊椎动物和脊椎动物中均存在。作为机体的第一道防线,固有免疫可以通过细胞免疫和体液免疫这两种方式来抵御外来病原的感染。在体液免疫中,无脊椎动物通过溶于血淋巴或位于细胞表面的模式识别受体(pattern recognition receptors, PRR)特异性地识别并结合病原表面包括肽聚糖(peptidoglycan, PGN)、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)和葡聚糖(β-glucan, GLU)在内的多种病原模式分子(pathogen-associated molecular pattern, PAMP),并激活相应的细胞信号转导途径,继而调控抗菌肽(antimicrobial peptide, AMP)的表达。为了深入研究中华绒螯蟹的免疫功能,本研究首先建立了一种新型的该蟹血细胞原代培养技术。该培养方法使用L-15培养基,在不添加血清和CO2的情况下,可以在280C条件下稳定培养血细胞达到30天。为了验证所培养血细胞是否具有免疫活性,首先检测了EsDWD1、EsLecG和EsTol12这三种免疫相关基因在不同PAMP刺激后的mRNA表达量变化,其次观察了所培养血细胞在不同浓度副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)刺激下的黑化情况,最后检测了MAPK信号通路中JNK、ERK和p38这三个信号分子的磷酸化情况。结果表明,该培养条件下的中华绒螯蟹血细胞具有较好的免疫活性,为其在免疫功能研究中的应用奠定了坚实的基础。已有研究表明,果蝇中不同的模式识别蛋白具有结合不同的病原微生物,并诱导产生特异性的抗菌肽以应对不同类型病原的现象,且该现象也在某些甲壳动物中被证实。然而,中华绒螯蟹中是也否具有该现象,且特异性的免疫效应因子有哪些却仍然不明。为了更为深入地了解中华绒螯蟹血细胞说分泌的免疫效应因子是否具有病原特异性,同时为了避免其它免疫相关组织如肝胰腺分泌蛋白的干扰,我们在血细胞原代培养的基础上,通过同位素标记相对和绝对定量技术(iTRAQ),对副溶血弧菌(革兰氏阴性菌)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(革兰氏阳性菌)刺激后血细胞所分泌的胞外蛋白进行绝对定量和相对定量分析,并从中筛选得到了在几种重要的免疫效应因子。其中包括凝血因子转谷氨酰胺酶(transglutaminase, TGase)和C型凝集素蛋白(C-type lectin, CTLD containing protein)。在之后的研究中,我们将深入研究这两种蛋白的免疫功能。转谷氨酰胺酶(TGase)是一种重要的凝血因子,同时在固有免疫中还具有直接抗菌功能,然而除了凝血功能外,其在中华绒螯蟹中是否还具有其它免疫功能尚未可知。由于在iTRAQ分析的结果中TGase出现了明显的上调,因此非常有必要研究其免疫功能。本研究首先克隆得到了cDNA全长达3248 bp的TGase (EsTGase),该基因包含一个长度达到2274 bp且编码757个氨基酸的开放阅读框(ORF)。其编码区含有2个transglut功能域和一个TGase/protease-like同源功能域,并含有一个KGD (Lys-Gly-Asp) motif。系统发育分析表明,该蛋白在进化上非常保守,可能是一种独特且古老的蛋白。EsTGase在血细胞中表达最为丰富,在免疫刺激后,EsTGase的表达量显著上调,与iTRAQ的结果相符,表明了其可能具备的免疫功能。通过RNA干扰技术(RNAi)将EsTGase敲降后发现,抗菌肽及免疫效应因子的表达量出现显著下调,且血细胞培养液中的细菌CFU数量显著上升,表明该蛋白可以通过调控抗菌肽来实现其免疫功能。作为一类模式识别蛋白(pattern recognition protein, PRP),C型凝集素(CTL)在固有免疫中具有识别并消除病原的重要作用。在iTRAQ的分析结果中,CTL是另一类在病原刺激后出现显著上升的蛋白。本研究在血细胞转录组数据的基础上筛选并首先克隆得到了一个CTL基因EsLecH,发现该CTL能结合不同病原并直接抑制其增值的同时,还能通过JNK信号通路调控抗菌肽的表达以实现其另一方面的免疫功能。EsLecH蛋白具有一个信号肽和单一的糖类识别功能域。该基因在不同组织中均有较高表达,且在免疫刺激后表达量显著上调。通过获得该基因的重组蛋白后的实验表明,EsLecH蛋白可以与不同的微生物结合,但其结合能力并不相同；Ca2+能显著增强该蛋白对细菌的结合能力,但该结合能力却不是Ca2+依赖的；该蛋白能明显抑制与其结合能力较强细菌的增值。此外,敲降EsLecH后能显著下调抗菌肽和JNK的磷酸化程度；在敲降JNK后,抗菌肽的表达同样显著下降,且不会随着EsLecH重组蛋白的加入而上升,表明EsLecH可以通过.JNK信号通路调控抗菌肽的表达。
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4
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本文编号：1295314