柔嫩艾美耳球虫病毒全基因组序列测定及转染载体的构建

发布时间：2017-12-16 22:24

  本文关键词：柔嫩艾美耳球虫病毒全基因组序列测定及转染载体的构建

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【摘要】：鸡球虫病是由艾美耳属球虫寄生在鸡肠道引起的全球性原虫病,每年在世界范围内因鸡球虫病造成的经济损失可达8亿美元。目前对鸡球虫病的防治主要依赖化学药物,但近年来,鸡球虫耐药性的不断增强以及人们对药物残留危害的逐步重视,使化学药物的应用受到极大限制。此外弱毒活疫苗存在毒力返强及扩大感染的风险,同时鸡球虫病原组成种类繁多,活疫苗生产和监测等环节复杂,使其预防效果也不尽理想。近年来基因工程鸡球虫疫苗成为研究热点,然而并未在实际生产中得到应用。造成这些问题的根本原因是对鸡球虫的生物学特性不明确,因此进行鸡球虫分子生物学研究、应用有效的基因工程技术对鸡球虫进行基因操作已成为现代鸡球虫病防治的重要研究方向。寄生性原虫双链RNA病毒(ds RNA viruses)已经在阴道毛滴虫、蓝氏贾第虫、利什曼原虫等寄生性原虫中发现。本研究在长春地区病鸡盲肠分离得到的柔嫩艾美耳球虫虫株中(Et611株)经试验发现,存在一种双链RNA病毒类似颗粒(直径约30纳米),并首次测定该病毒基因组序列,在此基础上又构建了柔嫩艾美耳球虫病毒转染载体。本研究内容为鸡球虫分子生物学特征研究提供了新的思路。柔嫩艾美耳球虫病毒全基因组测序通过三步测序法进行柔嫩艾美耳球虫病毒基因组测序,测定了新发现的ds RNA病毒基因组序列。测序结果显示,病毒基因组全长6006bp,包含两个开放阅读框(ORF1长度为2367bp,ORF2长度为3216bp),同时在两个开放阅读框的交界处存在五碱基长度的转换片段(UGA/UG)。BLASTp分析显示,柔嫩艾美耳球虫病毒与布氏艾美耳球虫病毒氨基酸序列最为接近。该病毒具有全病毒科的各项特征,可认定该病毒为全病毒科的一个新种。本研究测定的柔嫩艾美耳球虫病毒基因组是该病毒基因组的首次测定,依据国际病毒分类委员会的病毒命名规则,将此病毒暂命名为E.tenella RNA virus 1(Et RV1)。柔嫩艾美耳球虫病毒蛋白不同时期的表达通过对感染柔嫩艾美耳球虫的鸡盲肠上皮组织(速殖子)、未孢子化卵囊、孢子化卵囊的m RNA和蛋白样品分别进行RT-PCR和Western Blotting分析。结果显示Rd Rp蛋白在球虫的三个不同时期内,都获得了表达;而coat蛋白仅在球虫孢子化过程中表达。柔嫩艾美耳球虫病毒分子进化分析为了进一步对该病毒进行研究,对测得的Et RV1基因组序列和Totiviridae病毒科的全部病毒序列进行多重序列比对和进化树构建。分析结果表明,柔嫩艾美耳球虫病毒和布氏艾美耳球虫病毒与真菌病毒同聚类于Victorivirus属,而与其它的原虫病毒距离较远,不在同一分支上,因此艾美耳球虫病毒应划分为一个新亚属(Eimeriaviruses subgenus)。球虫病毒与宿主呈现整体协同进化关系。通过启动子区域预测,强烈显示Rd Rp编码框上游具有独立启动子。柔嫩艾美耳球虫病毒转染载体构建在柔嫩艾美耳球虫病毒序列的测定及病毒蛋白表达时期的研究的基础上,构建了柔嫩艾美耳球虫病毒载体。将绿色荧光蛋白(e GFP)和红色荧光蛋白(RFP)作为报告基因连缀于病毒序列中。使用电穿孔技术将含有报告基因的双链RNA载体转入柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊。经流式细胞术分选纯化可发荧光的柔嫩艾美耳球虫,并接种雏鸡,进行体内增殖传代。通过流式细胞术、免疫印记和激光共聚焦扫描试验,结果表明报告基因GFP、RFP和RFP-GFP在柔嫩艾美耳球虫传代的第二代到第四代虫体中均得以表达。柔嫩艾美耳球虫表达荧光蛋白的总体比例稳定于60%左右。柔嫩艾美耳球虫病毒转染载体的构建为柔嫩艾美耳球虫分子生物学研究奠定了基础。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.31

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