耐热木聚糖酶重组酵母高密度发酵工艺及其生物学特性研究

发布时间：2017-12-18 09:06

  本文关键词：耐热木聚糖酶重组酵母高密度发酵工艺及其生物学特性研究

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【摘要】：本论文旨在建立毕赤酵母产重组木聚糖酶的高密度发酵工艺、研究重组木聚糖酶对麸皮的降解特性、挖掘麸皮为代表的纤维类饲料功能潜能。试验一旨在利用分批发酵技术提高毕赤酵母表达的重组木聚糖酶活性。当培养基中添加20 g/L麸皮、5mg/LL-组氨酸、10mg/LL-色氨酸和10mg/LL-蛋氨酸时,酶活分别提高了 12.2%、7.4%、12.0%和9.9%。在1-L发酵罐中,自接种起,在处理Ⅰ中,于9 h、17 h补加1%(v/v)甘油,于 24h、32h、48h、56h、64h、72h、......、140 h 补加 0.5%(v/v)甲醇,在处理 Ⅱ 中,每24 h补加0.5%(v/v)甲醇,处理Ⅰ中最大菌体细胞干重和酶活分别是处理Ⅱ中的1.69倍和1.97倍,这表明甘油和甲醇含量极显著影响菌体细胞生物量和重组木聚糖酶活性,也为下一步试验研究中制定甘油、甲醇补料策略以获得高活性重组木聚糖酶奠定基础。-试验二旨在利用流加发酵策略高效表达重组木聚糖酶。在50-L发酵罐中,甘油流加发酵过程包括三个阶段,甲醇流加发酵过程采用四阶段补给速率逐步递增的发酵策略,菌体细胞干重最终达到53.48 g/L,与摇瓶中相比,酶活提高7.05倍。此外,在甲醇流加发酵初始72 h内,酶活与甲醇摄入量呈线性关系。重组木聚糖酶经膜分离浓缩,其陶瓷膜透过率为85.32%、纳滤浓缩了7.21倍、浓缩收率为94.97%。本试验制定了甘油、甲醇流加新策略,极显著提高了重组木聚糖酶活性。试验三研究了重组木聚糖酶的生物学特性。该酶最适反应温度和pH分别为80℃和8.0。在80℃条件下,处理10 min后,保留酶活为98.03%;处理50 min后,保留酶活为82.52%。在pH 11.0条件下,处理2 h后,保留酶活为97.40%;处理11 h后,保留酶活为89.01%。这表明该酶具有良好的耐高温、耐强碱性能。试验四研究了重组木聚糖酶对麸皮的降解特性、探究了降解产物中生物活性物质、旨在挖掘以麸皮为代表的纤维类饲料的功能潜能。在降解产物中,还原糖含量为614.0 μg/mL,其中木糖、阿拉伯糖和葡萄糖含量分别为23.8μg/mL、15.6μg/mL和17.3μg/mL;HPLC分析表明,木二糖含量为213.3 μg/mL、木三糖含量为174.0 μg/mL;总酚含量为129.44 μg/mL;LC-ESI-MS分析表明,阿魏酸含量为13.1 μg/mL。降解产物最大DPPH清除率为92.65%、总抗氧化活性为141.83 mg抗坏血酸g~(-1)粗木聚糖、Fe~(2+)鳌合能力为195.67 mg EDTA g~(-1)粗木聚糖。麸皮降解后释放木二糖、木三糖、阿魏酸等生物活性物质,具有良好的抗氧化功能。综上所述,本研究建立了毕赤酵母产重组木聚糖酶的高密度发酵工艺,高效表达了重组木聚糖酶,表明了该酶具有耐高温、耐强碱性能及对麸皮的降解特性,建立了释放麸皮中生物活性物质的方法,证实了以麸皮为代表的纤维类饲料具有功能潜能。
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S816

【参考文献】

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本文编号：1303571