绵羊血矛线虫感染致皱胃微生物群落、血矛线虫微生物群落及皱胃基因表达谱变化的病理生理学分析

发布时间：2017-12-20 04:09

  本文关键词：绵羊血矛线虫感染致皱胃微生物群落、血矛线虫微生物群落及皱胃基因表达谱变化的病理生理学分析　出处：《中国农业大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)是寄生于牛、羊等反会动物消化道的一种重要的寄生虫,可引起感染动物贫血、消瘦甚至死亡,给畜牧业造成极大的经济损失。目前,对羊的捻转血矛线虫病的防控主要依赖于抗虫药物。然而,该类药物的频繁使用导致产生了耐药性虫株,而逐渐被限制使用。再加上,捻转血矛线虫的疫苗并不能像细菌或病毒疫苗那样产生无菌免疫力。因此,很好的了解宿主与寄生虫之间的相互作用有助于对该病制定有效防控策略及生产管理规范。除此之外,还有很多制约开展该类研究的因素需要我们解决。比如,尚无合适的方法防止DNA或RNA在提取过程中降解;尚无在最短的时间内大规模从粪便中收集和纯化卵囊或虫卵的方法。目前已报道的大多数方法远远不能解决这些瓶颈。本研究目的是探索宿主与寄生虫之间的菌群种类及利用体内或间接体内系统揭示捻转血矛线虫在感染过程中虫体分子生物学特性。特别强调的一点是,我们对虫卵的提取和纯化、核酸的提取方法进行了优化。就传统的DNA或RNA提取方法而言,我们发现在裂解过程中核苷酸受到三重保护(如EDTA,SDS和NaCl),这个环境并不适宜RNase或DNase发挥作用。因此,完全去除RNA就要在DNA提完以后再加入RNase。同样,提完RNA后加入DNase去除DNA污染。另外,我们利用电奶油分离器和真空过滤装置收集和纯化艾美耳球虫卵囊和捻转血矛线虫卵,其回收效率分别高达81%和92%,孢子化率(存活率)分别是68%和74%。处理12升粪便悬液只需要7.5分钟。我们检测了捻转血矛线虫在早期和晚期感染过程中对皱胃和瘤胃菌群及宿主的影响。分离羊皱胃组织用于组织学和解剖学分析,并检测胃液的PH值。微生物菌群用于16SrRNA测序。结果表明,捻转血矛线虫感染增加皱胃胃液的PH值(P=0.04953),引起前盲囊乳突数量大量增加(P=0.0463),并导致坏死和炎症变化在急性感染阶段更加严重。羊感染H.contortus7天,皱胃和瘤胃菌群分别有98%和94%的细菌发生显著变化(P = 0.0369-0.0495)。然而,感染50天以后,菌群变化分别是 62%和69%(P = 0.0369-0.0495)。本研究利用Illumina MiSeq平台探索H.contortus在不同生活史阶段菌群的变化,扩增区域是V3-V4,和V5-V7区。V3-V4测序结果表明,H contortus菌群包括48个属,而V5-V7测序结果有 28 个属。优势菌分别是Escherichia-Shigella,Pseudomonas and Ochrobctrum,存在于线虫生活史的所有阶段。羊皱胃组织采自H.contortus感染后7天和50天,用于转录组测序。基于IlluminaHi Seq 4000平台的测序结果显示,与对照组相比,感染组在第7天有548个基因上调表达,有301个基因下调表达,50天感染组与7天感染组相比,有357个基因上调表达,355个基因下调,与对照组相比只有7个基因上调表达,11个基因下调表达。该结果表明,H.contortus.在感染早期与晚期相比更有效地激活皱胃基因的表达。为了研究H.contortus幼虫阶段入侵羊粘膜激发的直接免疫应答,我们建立了一个间接体内胃底粘膜模型来模仿体内不同细胞间的作用过程,来探索捻转血矛线虫感染早期基因表达情况。分离羊皱胃用于组织学和转录组学分析,上清液用于测定乳酸脱氢酶(LDH)的活性。免疫应答关键基因包括 IL-6,IL-8,C1q,CXCR-3,CXCL-2,超氧化物岐化酶,ITGA7/8/9,ITGB1,ITGB6,ICAM-1和Actin1表达水平发生变化。综之,上述结果表明,捻转血矛线虫感染对胃菌群的组成、多样性起到重要作用,线虫体内的菌群也反映了外部的微生物。此外,galectins可以被看作是宿主在H.contortus不同感染阶段发挥免疫调控作用的分子。本研究完全拓展了我们对宿主羊和捻转血矛线虫的微生物群的理解,及H.contortus感染即时期、早期和晚期羊胃基因表达情况,并改进了一些寄生虫学研究方面的技术,如卵的收集与纯化,核苷酸提取,这对后期研究提供重要的应用价值。此外,H.contortus诱导剂可引起防御相关基因的上调表达,并引发炎性反应和免疫调节应答。本研究展示了已经取得的研究成果,以期为胃肠道寄生虫的防控提供应用价值。
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S858.26

【参考文献】

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1 Nilusha Malmuthuge;Le Luo Guan;;Understanding host-microbial interactions in rumen:searching the best opportunity for microbiota manipulation[J];Journal of Animal Science and Biotechnology;2017年02期

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本文编号：1310685