禾谷镰刀菌蛋白激酶Prp4调控mRNA剪切机制研究

发布时间：2017-12-20 03:33

  本文关键词：禾谷镰刀菌蛋白激酶Prp4调控mRNA剪切机制研究　出处：《西北农林科技大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：前体mRNA剪切是真核生物中十分重要的基因表达调控机制;前体mRNA剪切的有序进行受到剪接复合体的调控,剪接复合体是由U1、U2、U4、U6和U5五种核小核糖复合体以及大量的非核糖核蛋白剪切因子组成的复杂的动态的复合结构。可逆磷酸化反应影响真核生物的大多数细胞活性,其中就包括前体mRNA的剪切过程;同时剪接相关蛋白的磷酸化在剪切进程中发挥重要作用。在所有的剪接体组成成分中,Prp4是其中唯一的蛋白激酶。尽管Prp4是裂殖酵母和其他真核生物生命活动所必须的蛋白激酶,但是在啤酒酵母中只有少量的长度较小的内含子并且缺少Prp4蛋白激酶的直接同源蛋白,同时在引起小麦赤霉病的禾谷镰刀菌中PRP4基因缺失突变体依然能够存活。禾谷镰刀菌中Prp4蛋白激酶不但具有一个保守的C端激酶结构域还具有一个额外的富含丝氨酸和精氨酸的N端亚结构域。对Prp4N端富含丝氨酸和精氨酸的310个氨基酸区域的敲除分析显示,这一部分对Prp4蛋白激酶的定位和功能起到重要的作用。对Prp4蛋白激酶的磷酸化组分析发现在这段N端区域含有一个能够被磷酸化的位点S289,这个磷酸化位点对Prp4正常行使功能具有重要作用。通过对我们的转录组测序数据进行分析发现,Prp4蛋白激酶并不是前体mRNA的内含子剪切所必须的蛋白因子,但是Prp4蛋白激酶在调控内含子剪切效率上发挥重要的作用;同时与剪切效率不受Prp4调控的内含子相比,Prp4蛋白激酶依赖的内含子在5’剪切位点与分支位点的距离上表现出长度更长的趋势。PRP4缺失突变体虽然能够存活但是表现出多种表型缺陷,并且能够产生恢复生长速率的自发抑制突变形成自发抑制子。超过300个生长速率恢复或者部分恢复的自发突变抑制子被分离得到,并且对其中的49个角变子进行了分生孢子产生量、有性生殖和致病性等方面的表型测定发现:49个角变子中没有一个能够完全恢复PRP4缺失突变体造成的缺陷。对角变子S2和S47进行转录组测序发现角变子只能部分恢复内含子的剪切效率。这些结果意味着所有角变子都不能完全恢复内含子的剪切效率。通过对三联体候选基因的测序分析发现,在PRP6、PRP31、BRR2和PRP8基因上能够鉴定到抑制突变的发生。在BRR2和PRP8上的两个抑制突变与从啤酒酵母或者是裂殖酵母中同源基因鉴定的突变变位点一致。而PRP6和PRP31中的突变位点还没有被报道。因为Prp31是三联体组成蛋白中前体mRNA剪切所必需的剪切因子;同时Prp31发生在R464位的无义突变造成了C端130个氨基酸区域的缺失,而这段区域中包含所有预测的在禾谷镰刀菌中十分保守的Prp4对Prp31的磷酸化位点,所以我们选择Prp31进行深入的研究。在本研究中通过对260个抑制角变子进行测序,发现在28个角变子的PRP31基因的C端尾巴上鉴定到抑制突变位点。我们通过酵母双杂交和免疫共沉淀分析发现,Prp31的C段区域能够与Prp31的N端区域发生相互作用而结合从而对Prp31的功能起到自抑制的作用。Prp31中起到抑制PRP4缺失造成缺陷的无义突变或者点突变都能够减弱Prp31与Prp6之间的相互作用,同时增强Prp31与Brr2之间的互作。我们进一步分析确定了禾谷镰刀菌中Prp31能够被Prp4蛋白激酶所磷酸化,进而对Prp31预测的保守磷酸化位点进行突变分析发现,Prp31中多个预测的磷酸化位点突变能够抑制PRP4缺失造成的表型缺陷,最后鉴定的S520、S521和T525三个磷酸化位点对Prp31的功能具有重要作用。Prp4对Prp31的磷酸化作用能够释放Prp31自身的自抑制结合,并影响Prp31与Brr2以及其他三联体组成蛋白之间的互作进而影响复合体B的激活。综上所述,我们的实验结果说明Prp4虽然不是前体mRNA剪切所必须的剪切因子,但是在调控内含子剪切效率上发挥着重要作用,并且Prp4通过对Prp31的磷酸化作用来调控剪切效率以及U4/U6-U5三联体之间的相互作用。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S435.121.45

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本文编号：1310606