玉米胞质类受体蛋白激酶基因ZmSTK2_USP的功能研究

发布时间：2017-12-22 20:37

  本文关键词：玉米胞质类受体蛋白激酶基因ZmSTK2_USP的功能研究　出处：《沈阳农业大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：花粉发育与花粉管伸长是玉米有性生殖过程中的重要事件,直接影响到玉米产量的高低和质量的好坏。花粉发育与花粉管伸长过程的分子机制极其复杂,除包括一系列器官分化和一系列严格控制的细胞生理生化变化外,还涉及大批基因的表达与调控。本研究发现一种新型的花粉发育相关胞质类受体蛋白激酶基因ZmSTK2_USP,具有调控玉米花粉的发育和花粉管伸长的生物学功能。研究取得的主要内容如下:(1)生物信息学分析表明,玉米ZmSTK2_USP基因的编码蛋白N-末端具有普通胁迫蛋白A(UspA)受体结构域,C-末端具有丝氨酸/苏氨酸激酶(STK)结构域;属于RLCK-IⅨb 亚家族。其启动子(proZmSTK2_USP)除含有 TATA-box、CAAT-box、G-box和GATA-box启动子典型元件外,还具有花粉特异性启动子元件GTGA和AGAAA。(2)花粉活力研究表明,突变体zmstk2_usp的花粉生活力下降43.30%,萌发率下降45.08%,以致单穗结实率下降约60.00%,且差异均达到极显著水平。(3)本研究成功克隆到ZmSTK2_USP基因,Northern blot检测分析表明,ZmSTK2_USP基因仅在成熟的花粉中特异性表达,且在其它组织(器官)中均未检测到。荧光定量PCR检测分析发现,ZmSTK2_USP基因在玉米花粉发育中期开始表达,且在成熟花粉中特异性表达。(4)本研究成功构建2个表达载体ZmSTK2_USP-GUS和ZmSTK2_USP-GFP,利用农杆菌介导的玉米萌动胚转化的方法获得玉米转基因植株。GUS组织化学染色检测结果表明,玉米转基因植株ZmSTK2_USP-GUS的幼小雄花、成熟雄花、成熟花药以及花粉ESP时期均未检测到GUS活性,但在花粉MSP时期、成熟期直至花粉管伸长均检测到GUS活性;采用农杆菌介导洋葱和烟草进行亚细胞定位分析,观察到ZmSTK2_USP-GFP融合蛋白在洋葱表皮和烟草叶片中瞬时表达都被定位在细胞质中,说明ZmSTK2_USP基因编码的蛋白属于胞质蛋白,这也为生物信息学分析中猜测ZmSTK2_USP属于胞质类受体蛋白激酶提供了依据。(5)本研究成功克隆到ZmSTK2_USP基因的启动子(proZmSTK2_USP),并成功构建表达载体proZmSTK2_USP-GUS,利用农杆菌介导的玉米萌动胚转化的方法获得玉米转基因植株,GUS组织化学染色检测发现,proZmSTK2_USP在成熟花粉和花粉萌发过程中调控基因表达,是一个花粉特异性启动子,这也验证了生物信息学分析的结果。(6)本研究还成功克隆到ZmSTK2__USP的激酶域(ZmSTK2__USP-KD),并构建带有His标签的表达载体pET30a-His-ZmSTK2_USP-KD,转化表达菌株BL21(E.coli)进行体外原核表达;目的融合蛋白为包涵体蛋白,最适诱导条件为IPTG浓度0.5mM、诱导温度37℃和诱导时间5hr,沉淀菌体需8M尿素溶液溶解处理。采用32P放射性同位素成像法及其激酶通用抗体的检测,鉴定出ZmSTK2_USP的激酶域能够发生自磷酸化,也可以催化组蛋白H1磷酸化,与此同时ZmSTK2_USP具有Ser/Thr蛋白激酶活性,不具有Tyr蛋白激酶活性,从而说明ZmSTK2_USP是一种非双底物特异性激酶。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S513

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本文编号：1320957