奶牛金葡菌乳房炎抗性的全基因组DNA甲基化表达调控及候选基因功能验证

发布时间：2017-12-24 00:00

本文关键词：奶牛金葡菌乳房炎抗性的全基因组DNA甲基化表达调控及候选基因功能验证　出处：《中国农业大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：金黄色葡萄球菌(金葡菌,Staphylococcus aureus S.aureus)是从隐性乳房炎奶牛乳汁中分离到的最常见的病原微生物之一,是导致奶牛隐性乳房炎最主要的接触传染性致病菌。奶牛金葡菌乳房炎是一种复杂疾病,具有潜伏期长,持续性感染,易产生耐药性等特征,目前尚无有效的疫苗,给奶牛场造成了极为严重的经济损失。奶牛金葡菌乳房炎受环境与病原菌的共同影响,遗传力较低,仅从病原菌角度或遗传学角度均难以对其进行有效的防控,而表观遗传学的兴起为奶牛乳房炎的研究提供了新的策略。DNA甲基化是相对稳定且可遗传的表观遗传修饰,抑制基因的表达,可作为研究奶牛金葡菌乳房炎等复杂疾病的切入点。因此本研究针对金葡菌隐性乳房炎牛和健康牛之间DNA甲基化的修饰差异以及调控模式展开研究,并构建奶牛金葡菌乳房炎体外细胞模型,研究奶牛金葡菌乳房炎抗性候选基因的功能和叶酸提高奶牛金葡菌乳房炎抗性的分子机理,为有效控制奶牛金葡菌乳房炎及其分子抗病育种提供遗传和表观遗传基础。主要结果如下:试验一:选取三头金葡菌隐性乳房炎牛和三头无金葡菌感染的健康牛为试验对象,采用MeDIP-chip技术鉴定外周血淋巴细胞全基因组启动子区DNA甲基化模式及修饰差异。共发现1078个差异甲基化基因,其中金葡菌隐性乳房炎牛相对于健康牛,上调甲基化基因有527个,下调甲基化基因有551个。DNA甲基化分布模式表现为:染色体亚端粒区甲基化水平显著高于非亚端粒区,DNA甲基化水平在TSS附近显著下降,且DNA甲基化负调控基因表达主要发生在金葡菌隐性乳房炎牛TSS上游1kb区。与表达谱数据进行整合分析,共发现58个差异甲基化且差异表达基因,其中MST1、NRG1和NAT9基因的DNA甲基化差异与奶牛金葡菌隐性乳房炎炎症相关,可作为潜在的金葡菌隐性乳房炎抗性候选基因。试验二:牛乳腺上皮细胞系Mac-T是一株具有正常乳腺上皮细胞形态与特征的永生化细胞系,正越来越多的被应用于乳房炎致病菌与宿主细胞的互作研究中。通过qRT-PCR方法检测金葡菌对Mac-T细胞的粘附和入侵,结果表明,Saue.和MRSA分别在90min和1Omin中的粘附力最强;S.aueus和MRSA分别在8h和6h时的侵袭力最强;且MRSA对Mac-T细胞的粘附能力和侵袭力极显著地强于S.aureus。通过对Mac-T细胞进行不同时间的攻菌处理,结果显示S.aureus和MRSA的最佳攻菌时间为6h,建立了 S.aureus和MRSA感染的奶牛金葡菌乳房炎体外细胞模型。试验三:选取TRAPPC9和JAK2作为奶牛金葡菌乳房炎抗性候选基因,利用RNA干扰技术对每个基因分别进行表达沉默。对基因干扰成功的细胞进行体外攻菌试验,结果显示Saureu.或MRSA感染导致TRAPPC9和JAK2基因mRNA表达水平显著下降,TRAPPC9基因的沉默可抑制NRG1、MST1和NAT9基因的表达,而TRAPPC9和JAK2基因的沉默会上调促炎细胞因子(IL6、IL1β)及趋化因子(IL8)的表达,从而增加金葡菌对Mac-T细胞的刺激作用。这些结果表明TRAPPC9和JAK2基因具有抑制金葡菌乳房炎炎症反应的作用,可作为奶牛金葡菌乳房炎抗性关键基因。试验四:在建立的奶牛金葡菌乳房炎体外细胞模型中,通过添加叶酸探究叶酸对奶牛金葡菌乳房炎的影响。结果表明叶酸通过促进金葡菌乳房炎抗性候选基因(TRAPPC9、JAK2、MST1、NAT9和NRG1)的表达及抑制炎症细胞因子(IL6、IL1β和IL8)的释放来抵抗金葡菌的入侵,达到缓解金葡菌乳房炎炎症反应的目的,且具有剂量效应,最佳处理浓度为5μg/mL。并提出"叶酸提高奶牛金葡菌乳房炎抗性的分子机理"假说:叶酸通过抑制NF-κB和JAK-STAT信号通路上相关的诱导因子IL8和IL6的表达来缓解奶牛金葡菌乳房炎炎症反应,对防控奶牛金葡菌乳房炎具有一定的积极作用。综上,本研究从表观基因组和分子遗传学方面深入挖掘奶牛金葡菌乳房炎抗性候选基因及进行功能验证,并探究了叶酸提高奶牛金葡菌乳房炎抗性的分子机理,为奶牛金葡菌乳房炎的表观遗传调控及分子抗病育种提供了数据支持和科学依据。
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S858.23

【参考文献】