针刺山羊激活的核团及诱导的阿片肽和抗阿片肽表达水平

发布时间：2017-12-25 00:18

本文关键词：针刺山羊激活的核团及诱导的阿片肽和抗阿片肽表达水平　出处：《华中农业大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：针刺镇痛在我国有悠久的历史,已广泛应用于疼痛疾病的治疗。电针是将脉冲电流通过针灸针导入穴位以代替手捻针法刺激,它与传统针刺相比,不仅镇痛效果更好,而且更容易调控刺激量。自上世纪60年代电针应用以来,人们采用神经生理学、生物化学和药理学的方法证实针刺镇痛是由神经和体液共同参与的生理性调整过程。大量研究也表明针刺可以通过激活中枢阿片能、去甲肾上腺素能、多巴胺能、血清素能或胆碱能神经系统产生镇痛效应;通过神经纤维、核团的电刺激或损毁以及神经递质或调质特异性拮抗剂阻断的方法,证实中枢特定神经核团和脑区参与针刺镇痛的调节。由于神经核团通过神经纤维网络相互联系、作用和影响,所以对特定神经核团各自功能的了解并不能完全阐明针刺镇痛的中枢调节机制。C-Fos和c-Jun是用于定位各种特异性外周刺激所引起中枢神经激活的可靠标志。试验选取35只健康成年山羊,随机分为5组,即空白组和不同频率(0,2,60和100 Hz,3.2 V)电针组,每组7只。对于电针组山羊,分别采用不同频率电针刺激“百会-三台、耳根-三阳络”组穴30 min。空白组山羊不作电针穴位刺激。采用钾离子透入法测定侧腹壁痛阈,免疫组化SABC方法检测中枢镇痛核团(脑区)c-Fos和c-Jun蛋白表达水平。拟观察的脑核团(脑区)包括伏核、外侧隔区、尾核、视上核、下丘脑室旁核)、下丘脑腹内侧核、弓状核、基底杏仁核、外侧缰核、黑质致密部、导水管周围灰质、臂旁核、蓝斑、中缝大核、巨细胞网状核孤束核。结果显示60 Hz电针诱导山羊痛阈升高82.2%,显著高于(0.01)其他频率。0、2和100 Hz电针诱导山羊痛阈分别升高6.4%、35.2%和40.9%。电针诱导c-Fos和c-Jun在多数镇痛相关神经核团和脑区中表达显著增加(0.05)。0 Hz组c-Fos和c-Jun免疫活性样神经元数(c-Fos-IR和c-Jun-IR)与空白组无显著差异(0.05)。与100 Hz相比,2 Hz电针诱导c-Fos-IR阳性神经元数在下丘脑腹内侧核、弓状核和基底杏仁核显著增多(0.05),c-Jun-IR阳性神经元数在下丘脑室旁核和基底杏仁核内显著增多(0.05)。与此相反,100 Hz电针诱导c-Fos-IR阳性神经元数在外侧僵核和黑质致密部以及c-Jun-IR阳性神经元数在伏核、外侧隔区和尾核显著高于(0.05)2 Hz。与2 Hz或100 Hz相比,60 Hz电针诱导c-Fos-IR和c-Jun-IR阳性神经元数在所测神经核团和脑区(中缝大核、巨细胞网状核、孤束核)中显著增加(0.05)。可见,60hz电针更为广泛的激活山羊中枢神经核团和脑区,产生较好的镇痛效应。在针刺镇痛的临床应用中,人们还发现持续电针较长时间或反复多次电针,电针镇痛的效果会显著下降,即产生“电针耐受”现象。研究表明,电针镇痛效应的发挥,主要是通过调节内源性的阿片肽,如内啡肽、脑啡肽和强啡肽等在中枢神经系统中的释放来实现的。研究者进一步发现,电针诱导内源性阿片肽释放的同时也增加抗阿片肽物质,如八肽胆囊收缩素、孤啡肽等的释放。抗阿片肽物质对抗内源性阿片肽的镇痛作用可能是电针耐受的重要机制之一,然而,电针耐受产生过程中脑内阿片肽、抗阿片肽的功能消长尚未阐明。为了探讨针刺镇痛的耐受机制,78只健康成年山羊随机分为空白组(6只)、假针组(6只)和电针组(66只)。对于电针组山羊,使用60hz(3.2v)电针持续刺激山羊“百会-三台、耳根-三阳络”组穴6h,分别于0、0.5、2、4、6、12、18和30h采用钾离子透入法检测侧腹壁痛阈,各时间点分别取6只羊安乐死,并采集中枢试验样本,包括伏核、尾核、丘脑室旁核、下丘脑室旁核、弓状核、海马区、杏仁核、丘脑中央中核、束旁核、中脑导水管周围灰质、黑质、中缝大核、巨细胞网状核、神经垂体和4~6腰椎段脊髓背角。采用elisa法检测脑啡肽(enk,脑内最重要阿片肽之一)含量,qpcr检测前脑啡肽(enk前体)和抗阿片肽(胆囊收缩素;孤啡肽前体)及它们的受体(μ-受体,cckbr和orl-1)基因的mrna含量。剩下的山羊在12、18和30h,各时间点分别随机选取6只山羊,给予额外的0.5h电针,电针前后测定痛阈来评估电针耐受恢复的状况。假针组山羊仅插针,不通电。空白组和假针组山羊保定和痛阈测定同电针组山羊。结果显示,空白组和假针组山羊痛阈率在试验期间无显著变化,两组间痛阈也无显著差异(0.05)。电针山羊痛阈率0.5h为89.9±11.7%,6h降至 11.4±8.9%,表明持续电针诱导镇痛耐受的形成。随后,山羊痛阈在12.5、18.5和30.5h分别为升高15.2±7.1%,21.8±9.4%,67.28±10.8%(与0.5h痛阈无差异,0.05),显示针刺耐受逐渐恢复。伏核enk在2~4h显著降低(0.01),6~30h仍保持较低的含量水平(0.05)。尾核、丘脑室旁核、下丘脑室旁核、弓状核、杏仁核和中脑导水管周围灰质enk含量均在0.5h达到峰值(0.05),但2h降至基础水平(0.05)。中缝大核enk含量无显著变化。脊髓背角enk含量呈现波动性变化,在0.5h显著升高,2h显著降低(基础值以下),随后逐渐回升,18 h再次降低于(0.05)基础值以下。被测神经核团(脑区)中ENK含量与山羊痛阈率之间呈正相关性(0.05)。持续电针抑制前脑啡肽mRNA在伏核、海马、弓状核和巨细胞网状核中的表达;抑制μ-受体mRNA在海马、束旁核、中脑导水管周围灰质、巨细胞网状核和脊髓背角中的表达。而持续电针增加胆囊收缩素mRNA在丘脑中央中核、束旁核、中脑导水管中央灰质、黑质和神经垂体中的表达,增加孤啡肽前体mRNA在伏核、弓状核、杏仁核、黑质、巨细胞网状核和神经垂体中的表达,增加胆囊收缩素受体mRNA在伏核、尾核、丘脑中央中核、黑质和脊髓背角中表达以及增加孤啡肽受体mRNA在下丘脑腹内侧核、丘脑中央中核、中脑导水管中央灰质、束旁核、黑质、中缝大核和神经垂体中的表达。本试验结果表明60 Hz诱导山羊较好的镇痛效应,这可能与电针广泛激活中枢镇痛相关核团有关。持续电针(6 h)诱导镇痛耐受,电针中止可使镇痛耐受在24 h内恢复。这一现象可能与中枢脑啡肽,八肽胆囊收缩素、孤啡肽以及他们受体在镇痛相关神经核团或脑区的表达方式有关。本研究初步阐明了针刺山羊镇痛的神经调节机制以及针刺镇痛耐受的机理,可为针刺镇痛在兽医临床上的应用提供理论基础。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S853.61

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