NDV调控PI3K介导的信号通路研究

发布时间：2017-12-25 05:23

本文关键词：NDV调控PI3K介导的信号通路研究　出处：《华南农业大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)感染引起的一种高度接触性传染病。强毒NDV能引起感染鸟类消化道和呼吸道出血或中枢神经系统损伤。自1926年在印度尼西亚和1927年在英国首次暴发ND以来,该疾病现已呈全球分布,包括亚洲、欧洲、非洲和南美洲等全球六大洲都曾多次报道过ND的疫情。目前在全球的多个国家以Class I、Class II基因VI型和基因VII型的NDVs流行和传播为主;但如基因XVII型和基因XVIII型等新型的NDV毒株不断在非洲等国家出现。NDV的宿主范围非常广,能感染超过250种鸟类,而野鸟一直被认为是NDV的天然宿主和传播载体,带毒的野鸟可能通过直接接触在鸟类,甚至在家禽间传播该疾病,对养禽业造成巨大的经济损失,然而目前带毒的野鸟和家禽之间的传播模式仍然有待进一步研究。因此,从2010年开始,我们对广东省活鸟市场进行NDV的流行病学监测,并且进一步研究在不同宿主上分离到的NDV对不同鸟类的致病性和传播特性。在本研究中,从广东省活鸟市场中鸡、鸭和鸽等宿主中分离到25株NDVs,并对这25株NDVs的基因型和致病特性进行了分析。为了模拟活鸟市场不同种鸟类的自然传播特性,选择了其中5株分别分离于鸡(GM)、鸭(SS-10、NH-10和YF18)、鸽(GZ289)不同宿主的代表性毒株,研究它们分别对鸡、鸭和鸽不同宿主的致病性和传播特性。对鸡、鸭和鸽通过点眼滴鼻方式分别以106 EID50接种病毒,感染8 h后,分别在每个感染组的实验动物中放置相对应的3个同居对照动物做水平传播实验。实验结果表明广东省内活鸟市场存在多种NDV的基因型,并且来源不同的鸟类有不同的组织趋性和宿主范围。病毒感染与致病是病毒和宿主相互作用的结果,既有病毒为逃避宿主防御机制而发挥抗病毒作用,维持自身的复制,也有宿主为清除病毒而调动固有免疫体系迅速产生效应分子和免疫效应,构建机体抵御病毒入侵的生物防线。为了阐明NDV的致病机制,本研究通过NDV感染鸡胚成纤维(Chicken embryo fibroblast,CEF)细胞在病毒感染早期短暂激活PI3K/Akt信号通路,并且在NDV感染CEF细胞15 min后观察到Akt磷酸化。而NDV激活Akt的磷酸化在感染后1 h达到顶峰,感染24 h后逐渐减弱。紫外灭活的NDV也能够激活PI3K/Akt信号通路,表明激活这条信号通路并不需要病毒复制。另外,在NDV感染CEF细胞前先用PI3K特异性抑制剂LY294002或者Wortmannin处理CEF细胞后再用NDV感染处理过的细胞,能够明显观察到Akt的磷酸化被抑制了,同时NDV病毒滴度也减少。最后,网格蛋白介导内吞作用的抑制剂甲基-β-环糊精和氯丙嗪能够抑制GM和F48E9毒株诱导的Akt磷酸化,却对疫苗毒La sota诱导的Akt磷酸化没有明显影响,提示NDV侵入细胞可能与PI3K/Akt信号通路有关。然而,抑制PI3K/Akt信号通路的激活能够加强NDV感染CEF细胞早期诱导的细胞凋亡反应,如Caspase 3和PARP裂解加强、GSK 3β磷酸化减少和Annexin V-FITC/PI染色的凋亡细胞增多。此外,泛半胱天冬酶抑制剂ZVAD-FMK和PI3K抑制剂LY294002能够通过抑制细胞凋亡促进PI3K激活,导致Akt磷酸化增多和病毒复制增强,同时促进NDV感染的细胞宿主生存,提示PI3K/Akt信号通路具有抗凋亡作用和促进NDV复制。根据底物特异性和序列同源性,PI3K分为3类:class I、class II和class III。PI3K I类激活Akt/mTOR信号通路,促进营养物质的摄取和代谢活动抑制自噬,然而PI3K III类Vps34结合Vps15转换PI为PI(3)P促进自噬的发生。NDV既能诱导自噬,也能诱导细胞凋亡。尽管细胞凋亡和自噬承担不同的形态特征和生理过程,然而两者之间存在错综复杂的相互作用仍然不明确。因此为了深入阐明NDV的致病机制和探讨NDV与宿主细胞相互作用的分子机制,本研究分析了NDV诱导PI3K介导的自噬和细胞凋亡对NDV复制的作用。在本研究中,相对于阴性对照组,NDV感染或者饥饿诱导CEF细胞在早期能观察到LC3-I向LC3-II转化、p62/SQSTM1发生降解和通过透射电子显微镜观察到自噬体增多等现象,表明NDV感染或者饥饿诱导CEF细胞能够诱导自噬。然而紫外灭活的NDV感染CEF细胞却没有能够观察到LC3-I向LC3-II转化、p62/SQSTM1降解等现象,同时Caspase 3和PARP也未发生裂解,说明自噬体的产生需要病毒复制。在体内外NDV感染实验发现,NDV感染早期可以观察到Caspase 3和PARP分裂以及通过FITC-V/PI染色的凋亡细胞数均表明抑制自噬能够加强细胞凋亡反应。类似地,诱导自噬减少细胞凋亡反应。此外,除了Beclin 1,诱导自噬能够增加NDV感染SPF鸡的脾脏和肺脏中的自噬相关基因、抗凋亡因子(Bcl-2和Bcl-x L)和促炎症因子(IL-6和IL-1β)的表达水平,同时减少脾脏和肺脏中的凋亡细胞。然而半胱天冬酶通用抑制剂ZVAD-FMK抑制细胞凋亡能够促进LC3-I向LC3-II转化和p62/SQSTM1发生降解,同时还能够增强病毒复制,表明抑制NDV感染CEF诱导的细胞凋亡能够促进自噬的发生和细胞生存。综上所述,研究结果揭示了PI3K/Akt信号通路和自噬与细胞凋亡的关系对NDV感染宿主细胞的分子机制,这将有助于理解NDV与宿主细胞相互作用的分子机制和NDV的致病分子机制,为ND的防控提供新的思路。
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65

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