甘草酸合成调控网络中ABA关键功能基因NCEDs变异对甘草酸合成的影响研究

发布时间：2017-12-25 13:28

  本文关键词：甘草酸合成调控网络中ABA关键功能基因NCEDs变异对甘草酸合成的影响研究　出处：《北京中医药大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

  更多相关文章： 甘草 甘草酸 网络调控 脱落酸 NCED SNP

【摘要】：甘草作为常用大宗药材,素有“国老”之称,在国内外均有很大用量。然而,随着甘草野生资源的匮乏,栽培甘草已成主流商品的主要来源,但多数栽培甘草存在质量下降问题,其中以甘草酸最明显,多数栽培甘草中的甘草酸含量达不到15版《中华人民共和国药典》与16版《日本药局方》规定的2.0%与2.5%的要求。这一问题如不能突破,不仅影响其临床疗效,最终制约其出口远销,因此提高栽培甘草中甘草酸含量成为亟待解决的问题。通过本课题组前期研究与查阅文献发现植物中次生代谢产物的合成途径存在一个相互联系相互影响的代谢网络。因此本论文试图从构建促进甘草酸合成的调控网络入手,筛选促进甘草酸合成的内源性调控物质,并从产量及关键功能基因表达两方面解析该物质促进甘草酸合成的机制,进而通过对不同种质调控物质含量变异的测定,分析不同种质自然状态下该物质的含量状况,通过调控该物质合成的关键功能基因的多态性与调控物质含量及甘草酸含量的相关性,解析该物质及甘草酸含量差异形成的分子机制,为甘草及其他药用植物优良种质的筛选提供依据。具体结果如下：1.通过外施不同浓度的6种激素筛选出促进甘草酸合成的最佳调控物质为ABA。在6月中旬(生长初期)及7月中旬(生长中期)对甘草喷施不同浓度ABA、GA、MeJa、 6-BA、BR及IAA,运用HPLC测定7月、8月、9月及10月四个取样时期甘草的甘草酸、甘草苷与其他5种黄酮类(异甘草苷、芹糖基甘草苷、芹糖基异甘草苷、甘草素、异甘草素)成分的含量。结果表明：第一,6月中旬进行的ABA各处理中对甘草酸、甘草苷促进效果较好的处理浓度均为25mg/L,4个取样时期甘草酸含量分别比对照高78.96%、52.28%、46.43%及52.01%,甘草苷含量分别比对照高25.61%、47.80%、101.62%及27.85%,差异均达显著水平；7月中旬进行的ABA各处理中对甘草酸促进效果较好的处理浓度为50mg/L,对甘草苷促进效果各浓度均弱于6月中旬；不同浓度ABA对甘草其他5种黄酮类成分的含量影响差异均不显著。第二,6月中旬进行的6-BA各处理中对甘草酸、甘草苷促进效果较好的处理浓度均为100mg/L,4个取样时期甘草酸含量与对照差异达显著水平；7月中旬进行的6-BA各处理中对甘草酸、甘草苷促进效果较好的处理浓度仍均为100mg/L,在3个取样时期的甘草酸及甘草苷含量与对照相比差异达显著水平；不同浓度6-BA对甘草其他5种黄酮类成分的含量影响差异均不显著。第三,GA、MeJa、BR及IAA对甘草苷及甘草酸的影响效果均低于ABA及6-BA,且与对照差异不显著；而对其他5种黄酮类物质的影响均不稳定,且总体差异并不显著。第四,通过整体评价,在6种激素中,ABA处理效果最好,6-BA其次,这两种激素不但能够显著提高甘草中甘草酸及甘草苷的含量,而对其他5种黄酮类物质总体影响表现为不显著。第五,低浓度ABA对甘草7种成分有一定的促进作用,高浓度ABA与之相反；0-50mg/L区间内,与甘草苷、异甘草苷及甘草酸呈极显著正相关(P0.01),与芹糖异甘草苷呈显著正相关(P0.05)；而在50-200mg/L区间时,ABA同样与所有7种成分出现负相关关系,并与甘草酸呈极显著负相关(P0.01)。其他5种激素与甘草7种成分相关关系不一。因此,ABA是一种良好的促进甘草酸合成的调控物质。2.脱落酸(ABA)通过促进β-AS基因的表达促进甘草酸合成。以6月中旬(生长初期)及7月中旬(生长中期)喷施不同浓度ABA甘草样品为材料,测定甘草植株的生长及产量特征指标；以不同浓度ABA处理的甘草种苗为材料,对β-AS的相对表达量进行测定分析。结果表明,第一,不同浓度ABA处理1年生甘草植株在处理初期对其生长指标产生不同程度影响。两个处理时期第一次取样时,100mg/L及200mg/L ABA处理样品的株高、地径、根粗、根鲜重均低于对照,但这种阻碍作用随处理甘草的生长发育逐渐消失。而25mg/L及50mg/L ABA处理甘草则对甘草生长发育总体影响不显著。第二,低浓度ABA处理均可以持续促进β-AS的表达,而高浓度ABA在处理时间较长时则会对其表达起阻碍作用。不同浓度ABA处理甘草幼苗,在3h及6h时,所有处理均能促进β-AS的表达,与对照相比差异均达到显著程度。但12h取样时,100mg/L及200mg/L ABA处理样品的β-AS的相对表达量显著降低,至24时,两者相对表达量均显著低于对照。3.甘草NCEDs基因家族成员的克隆及功能的初步验证。以整珠甘草幼苗为材料,提取总RNA,进行逆转录,克隆NCEDs基因家族成员：NCED1、NCED3、NCED4。结果表明,NCED1、NCED3及NCED4的开放阅读框全长分别为1830bp、1830bp及1764bp。3个基因均有一个外显子,均不含内含子。3个基因分别可以编码609、609及587个氨基酸。其假定蛋白的分子量分别为67.56 kDa、67.29kDa及63.98kDa,等电点分别为6.64、5.95及6.26。利用PEG模拟干旱对甘草进行处理可以促进NCEDs3个基因的表达,而且其表达与ABA含量的增加具有同步性,结合文献可以初步确定我们克隆到的NCEDs就是甘草ABA合成的关键功能基因NCEDs。4.研究不同种源甘草中甘草酸等有效成分及激素类物质的变异。以采集过甘草叶样对应植株的根为材料,主根用于测定甘草酸、甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素5种成分含量,根尖用于测定内源6-BA、ABA、GA、MeJa及BR的含量。结果表明,第一,不同种源间甘草酸含量整体差异达显著程度(P0.05),13个产地中甘草酸含量最高的种源来自山西应县,为2.29%,最低的来自甘肃民勤,为1.28%；不同种源内甘草酸含量极差最大的种源来自内蒙古杭锦旗巴音乌素镇,其极差为2.95%,最小的来自内蒙古敖汉旗,其极差为0.98%,仅为最大极差的33.22%,说明种源间及部分种源内部均存在较丰富的变异。不同种源间甘草苷、异甘草苷及异甘草素含量整体差异达显著水平,不同种源间甘草素含量总体差异不显著。第二,不同种源间ABA含量整体差异达极显著程度(P=0.0020.01)；13个种源中ABA极差大于100ng·g-1. FW的种源有4个,小于100ng·g-1.FW大于40ng·g-1. FW的种源有8个,小于40ng·g-1. FW的种源有1个。第三,不同种源间6-BA、MeJa及GA含量整体差异分别达极显著、显著、极显著水平,BR差异未达显著程度。5.在来自13个种源的样品中克隆并测序成功3个基因的样品数分别为65个、67个及36个,分别发现SNP位点的个数分别为14个、14个及29个。根据NCED1基因SNP位点的情况将样品分为22个基因型；根据NCED3基因SNP位点的情况可将分为29个基因型；根据NCED4基因SNP位点的情况,可将样品分为27个基因型。发现部分种源在多个基因型中均有分布,说明种源内部具有较丰富的变异；而有的基因型包含不同种源的样品,说明不同种源间又存在一致性的特点。6.甘草酸与脱落酸(ABA)含量变异的分子机制研究。以第六、七章实验数据进行甘草NCEDs3个基因SNPs位点分别与脱落酸及甘草酸含量的灰色关联分析。结果表明,第一,NCED1基因、NCED3基因及NCED4基因所有SNP中与甘草酸含量关联系数大于0.8的变异位点分别占相应基因变异位点总个数的78.57%、76.92%及72.41%,说明3个基因多数变异SNP位点对甘草酸合成与积累均具有较强的促进作用。其中3个基因与甘草酸含量关联系数最大的分别为NCED1基因437bp(GA),NCED3基因966bp(GA)及NCED4基因845bp(AG)。第二,NCED1基因所有变异位点中与ABA含量关联系数大于0.8的变异位点占总变异位点的78.57%,而NCED3基因所有变异位点的关联系数均在0.8-0.7之间,NCED4所有变异位点中关联系数大于0.7的个数占总变异位点数的68.97%。说明3个基因中NCED1基因变异位点对本取样时期ABA合成与积累总的作用要优于其他两个两个基因,但其他两个基因对ABA合成和积累也具有一定作用。综上,在进行高甘草酸种质的筛选时应该优先考虑的变异位点为NCED1基因437bp处A型,NCED3基因966bp处A型及NCED4基因845bp处G型。
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S567.71
，

本文编号：1333027