Gsdf和Wt1在罗非鱼性别分化和性腺发育中的功能研究

发布时间：2017-12-25 15:15

  本文关键词：Gsdf和Wt1在罗非鱼性别分化和性腺发育中的功能研究　出处：《西南大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：许多养殖鱼类生长具有明显的性别二态性,性控育种技术是水产养殖增加产量和提高效率的有效途径。尼罗罗非鱼雄鱼比雌鱼生长快,全雄养殖还可避免过度繁殖,因此,单性化养殖是罗非鱼行业标准。尼罗罗非鱼是一种世界性的养殖鱼类,性别受到单基因决定,具有XX/XY性别决定系统,人们提出遗传全雄罗非鱼(genetic male tilapia,GMT)技术控制性别,即采用YY超雄罗非鱼与正常XX个体交配繁殖全雄XY鱼,但是至今这个技术还没有在水产养殖中推广,难点在于YY维持系的建立,YY雌鱼诱导难度大,需要更高的雌激素处理浓度和更长的处理时间,即便获得YY雌鱼其育性也很低,本实验室获得的YY雌鱼甚至不育,目前亟须围绕这个问题开展罗非鱼性别决定与分化的分子机制研究,为最终实现其遗传性别控制的应用提供理论基础和技术方法。gsdf是鱼类特有的TGF-?家族成员基因,在鱼类精巢高表达,最近在青溕中的研究表明它在精巢分化中具有重要作用。Wt1在哺乳类参与雄性别决定与分化,而在鱼类中的功能不是很清楚。而鱼类由于鱼类特有的基因组的复制(3R)具有2个亚型:wt1a和wt1b。本研究通过CRISPR/Cas9建立了罗非鱼gsdf和wt1敲除系,并对敲除系进行分析,研究gsdf和wt1在性别分化和性腺发育中的作用,并在ZX奥尼杂交雄性罗非鱼(尼罗罗非鱼XX♀×奥利亚罗非鱼ZZ♂)中敲除gsdf研究其在鱼类性别分化中功能是否保守,主要研究结果如下:1、在本实验室前期通过CRISPR/Cas9在尼罗罗非鱼敲除gsdf获得F0代阳性鱼的基础上,采用F0代阳性鱼开展gsdf基因纯合敲除建系,分析了F0代XY嵌合体敲除率与性腺表型的关系,以及gsdf敲除的F1代杂合子和F2代纯合子的表型。发现敲除率"g58%的XY性腺在90 dah(days after hatching,孵化后天数)时发育为卵精巢,在180和240 dah时完全逆转为卵巢,敲除率58%的XY性腺发育为正常精巢,F1代XYgsdf+/-性腺都发育为精巢,而F2代XY gsdf-/-性腺都发育为卵巢。通过F1代XY gsdf+/-与F0代性逆转的XY雌鱼回交,获得了YY gsdf-/-,60dah时通过组织学观察显示它们都发育为卵巢。说明gsdf是尼罗罗非鱼雄性性别分化所必需的基因,且在雄性性别分化过程中gsdf的需求有一定阈值。2、免疫组化检测纯合突变性腺分化早期的基因表达发现:xygsdf-/-性腺在10dah雄性通路已经开启,表达dmrt1,然后在18dah,雌雄通路都开启,同时表达dmrt1和cyp19a1a,在孵化后36天,关闭了雄性通路,仅开启雌性通路,只表达cyp19a1a,并出现i时相的卵母细胞,完成了由雄向雌的性逆转,表明在没有gsdf的情况下,xy性腺可开启雄性信号通路,表达dmrt1,但不能够维持。通过对正常xy性腺邻近切片免疫组化分析发现4dah时gsdf和dmrt1均没有表达,而在5dah之后,gsdf和dmrt1共表达于性腺的支持细胞。对gsdf启动子序列分析发现上面具有一个dmrt1的结合位点。在hek293细胞中进行gsdf启动子分析发现dmrt1单独转染不能激活gsdf的转录,当与sf1共转染时dmrt1能够剂量依赖地增强sf1激活的gsdf转录。这些结果表明在尼罗罗非鱼雄性性别决定通路中gsdf是dmrt1的下游靶基因。3、通过real-timepcr检测90dahgsdf-/-性腺基因表达,发现促进雌激素合成酶cyp19a1a表达的基因foxl2在xygsdf-/-个体的表达水平显著高于正常的xygsdf+/+个体,而与xxgsdf+/+和gsdf-/-个体差异不显著,雄激素合成酶cyp11b2在xygsdf-/-个体的表达水平显著低于正常的xygsdf+/+个体,而与xxgsdf+/+和gsdf-/-个体差异不显著,血清雌激素(e2,17β-estradiol)和雄激素(11-kt,11-ketotestosterone)水平检测得到与此相一致的结果。通过芳香化酶抑制剂(aromataseinhibitor,ai)投喂处理xygsdf-/-个体,处理时间从10到35dah,能够回救敲除表型,性腺发育为精巢,表达dmrt1和cyp11b2,回救鱼在180dah能产生正常精子,并能够正常授精。表明gsdf可能通过下调雌激素的合成、上调雄激素的合成而促进精巢的分化,但其涉及的分子机制有待阐明。4、引入奥利亚罗非鱼培育建立纯系和杂交系。将zz奥利亚雄鱼与尼罗罗非鱼xx雌鱼交配,获得了100%的zx雄性罗非鱼。将zx雄鱼与尼罗罗非鱼xx回交,获得了1:1的雌雄性比。将zw奥利亚雌鱼与yy超雄尼罗罗非鱼杂交,获得了100%雄性后代。奥利亚zz雄鱼与zw雌鱼交配,获得了1:1的雌雄比后代。采用fadrozole处理能将奥利亚zw雌鱼逆转为正常雄鱼,zw雄鱼与尼罗xx雌鱼杂交,获得1:1的雌雄性比后代。将zw雄鱼与zw雌交配,可以获得3:1的雌雄性比。结合尼罗非鱼xx为雌鱼,xy为雄鱼,以及奥利亚非鱼zz为雄鱼,zw为雌鱼的事实,说明了在尼罗和奥利亚罗非鱼性染色体的性别控制能力由强到弱为:ywzx。通过转录组测序分析获得了奥利亚罗非鱼的gsdforf序列,发现其与尼罗罗非鱼序列相似度达到99.5%。通过免疫组化研究了gsdf在zx全雄杂交罗非鱼性腺的10dah表达,发现zx性腺与xy性腺一样高表达gsdf。进一步在zx鱼crispr/cas9敲除gsdf,近一半f0代阳性鱼性逆转为雌鱼,证明了gsdf在不同遗传背景下保守的促进雄性性别分化的功能。5、通过原位杂交研究了wt1a和wt1b的表达。在肾脏中,wt1a表达于3、5、20和40 dah肾小球中,而wt1b在3dah的肾小球中不表达,5、20和40 dah都表达于肾小球中。在早期性腺中,wt1a和wt1b都表达于3和5 dah的性腺体细胞中;在成鱼卵巢中,wt1a表达于颗粒细胞、鞘膜细胞和间质细胞,wt1b表达于间质细胞;在成鱼精巢中,wt1a表达于支持细胞,wt1b表达于间质细胞。通过CRISPR/Cas9敲除了wt1a和wt1b,并分别构建了纯合敲除系。wt1a-/-在6 dah时出现严重腹水,10 dah全部死亡,wt1b-/-不致死。进一步组织切片观察发现6 dah时wt1a-/-个体的肾脏中未见肾小球形成,wt1b-/-和对照的肾小球发育正常。wt1a在肾小球早期单独表达,可能对其发育至关重要,wt1b不能补偿wt1a在肾脏早期发育中的功能。在180 dah对wt1b纯合敲除的后代进行分析:组织学观察发现XX wt1b-/-性腺发育为正常的卵巢,XY wt1b-/-性腺发育为正常的精巢;免疫组化分析显示wt1b-/-的XX性腺表达Cyp19a1a,不表达Cyp11b2,wt1b-/-的XY性腺,表达Cyp11b2,不表达Cyp191a;血清激素水平显示,wt1b-/-的XX个体E2和11-KT与对照XX(wt1b+/+和wt1b+/-)雌鱼差异不显著;XY wt1b-/-个体E2和11-KT对照XY(wt1b+/+和wt1b+/-)雄鱼差异不显著。wt1b-/-的雄性个体在180 dah时能产生精子,并能够正常授精。wt1a纯合敲除致死,其对性别决定的功能不得而知,而wt1b纯合突变不会影响罗非鱼存活和性别决定,wt1b在精巢发育中的功能冗余,在卵巢发育是否冗余需要进一步验证。综上所述,gsdf纯合敲除能够导致XY和YY鱼性别逆转,证明是Gsdf在罗非鱼雄性性别决定通路必需基因。也为建立罗非鱼YY维持系提供了新的技术途径。Dmrt1能在gsdf纯合敲除后的XY性腺表达,gsdf启动子具有Dmrt1结合位点,且启动子分析发现Dmrt1在Sf1存在的情况下能上调gsdf的转录,表明gsdf在罗非鱼雄性性别通路中位于dmrt1的下游。gsdf可能是通过下调雌激素水平、上调雄激素水平来控制雄性性别的。与XY一样,在ZX杂交鱼中敲除gsdf同样导致由雄向雌的性逆转,证明Gsdf在具有不同遗传背景的罗非鱼雄性性别分化中功能保守。wt1a纯合敲除致死说明wt1a对于罗非鱼存活至关重要,且wt1b不能补偿wt1a的功能。wt1a纯合敲除致死,其对性别决定的功能不得而知,wt1b纯合敲除不会影响罗非鱼的性别表型,在成鱼阶段,wt1b的缺失不会影响罗非鱼雄鱼生殖功能,对雌鱼生殖的影响有待进一步证明。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4
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本文编号：1333348