草坪草耐热及叶片伸长相关扩展蛋白基因的克隆和功能研究

发布时间：2017-12-25 16:06

本文关键词：草坪草耐热及叶片伸长相关扩展蛋白基因的克隆和功能研究　出处：《北京林业大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：扩展蛋白是植物细胞壁的重要组成成分,具有疏松细胞壁的功能,在植物生长发育的各个阶段以及抗逆方面均发挥重要作用。本实验室前期从耐热粗粝翦股颖(Agrostis scabra)品种'NTAS'中成功鉴定出一条与草坪草耐热相关的扩展蛋白基因AsEXP1,该基因受高温诱导表达,并且在耐热品种中表达量高,在不耐热品种中表达量低或者不表达。本研究通过基因克隆以及生物信息学手段,对不同草坪草品种中的AsEXP1同源基因进行了序列多样性分析；利用农杆菌介导法将草地早熟禾(Poapratensis)品种'Diva'叶片中的AsEXP1同源基因PpEXP1导入烟草(Nicotiana tabacum)中过量表达,探讨了PpEXP1基因在植物抵御高温中的作用；同时,通过对高羊茅(Festuca arundinacea)不同品种(快速生长品种‘K-31’和矮化品种'Bonsai')在不同激素处理以及逆境条件下扩展蛋白基因家族成员表达水平的分析,探讨了不同扩展蛋白基因在草坪草生长及抗逆反应中的作用。主要研究结果如下：(1)对3个属共计12个草坪草品种AsEXP1同源基因DNA全长序列进行克隆和序列比对,结果显示,不同品种之间,AsEXP1在基因长度以及碱基序列方面均存在种属特异性变异,并且内含子变异幅度明显高于外显子。据此设计3对特异PCR引物组合,并在6属32个常见草坪草品种中进行PCR验证,结果显示,引物组合cAs3F/cAs3R和cAs4F/cAs4R可以分别鉴定常见的翦股颖属(Agrostis)和早熟禾属(Poa)草坪草品种,而引物组合cAs5F/cAs5R只在羊茅属(Festuca)和黑麦草属(Lolium)中有扩增。根据AsEXP1同源基因序列绘制不同草坪草间的系统进化树,发现同属的草坪草品种聚在同一分支,不同属的草坪草品种分在不同的分支,说明AsEXP1基因序列中存在植物进化的线索,可为草坪草亲缘关系研究提供重要的基因信息。(2)对转PpEXP1基因烟草和野生型烟草株系同时进行高温处理(42℃,6d),野生型烟草植株呈现严重的萎蔫,多数叶片变黄,而转基因植株则只有底部较少叶片出现萎蔫变黄。叶片相对含水量、相对电导率、叶绿素含量、光合作用效率、过氧化氢含量、超氧化物歧化酶活性以及丙二醛含量等多项生理指标显示,转基因烟草具有更强的耐热性。同时,组织切片结果显示,转基因烟草的叶肉细胞结构在高温条件下无明显变化,细胞轮廓清晰,且大部分细胞保持完整,而野生型植株在高温处理后叶肉细胞完整性受到严重破坏,细胞边缘模糊不清。综上,PpEXP1基因的高表达可显著提高烟草的耐热性。(3)对不同高羊茅品种以及不同处理条件下扩展蛋白基因表达水平进行检测,发现：高羊茅不同品种叶片伸长速率差异显著,EXPA1和EXPA3的表达量在生长速率高的品种‘K-31’叶片中显著高于生长速率低的品种'Bonsai';进一步分析显示,高羊茅同一叶片的不同区段伸长速率不同,而扩展蛋白基因EXPA3在伸长速率快的区段具有更高的表达水平；外施赤霉素后,EXPA1、EXPA2、EXPA3、EXPB1等扩展蛋白基因的表达量升高,而叶片伸长速率也明显提高；干旱、盐胁迫条件下,叶片伸长速率降低,扩展蛋白基因EXPA3在草坪草叶片中的表达量也随之降低。综上,扩展蛋白基因EXPA3的表达水平与草坪草叶片的伸长速率密切相关,为深入探讨草坪草生长的分子机制奠定了基础。
【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S688.4

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