玉米赤霉烯酮免疫学快速检测技术研究
本文关键词：玉米赤霉烯酮免疫学快速检测技术研究 出处：《甘肃农业大学》2017年博士论文 论文类型：学位论文
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【摘要】：玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是由镰刀菌分泌的一类真菌毒素,功能与雌激素类似,无论在田间的谷物上,还是在贮藏的谷物及谷物制品(包括食品及饲料)中都可以检测到。ZEN可以活化雌激素受体,从而损害动物的生殖系统,由于ZEN中毒事件频繁发生,引起了兽医界的广泛关注。动物摄食被ZEN污染的饲料后,可能导致“高雌激素综合症”,肝毒性、细胞毒性、免疫毒性和致肿瘤等多种毒害作用,给畜牧养殖业带来巨大的经济损失,严重威胁动物及人类健康,给兽医、畜牧养殖管理部门及食品安全监管部门带来了巨大的压力,因此很多国家都对粮食及饲料中ZEN制定了严格的限量标准,并研究其快速、准确及敏感的监测方法。免疫学分析技术因其具有灵敏,特异,快速及高通量等优点,已被广泛应用于真菌毒素污染的快速检测中。为了获得特异、灵敏的ZEN免疫学快速检测方法,本研究对ZEN的分子结构、人工抗原的偶联方法等进行了分析,通过动物免疫及细胞融合,筛选出分泌ZEN单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并通过体内诱生腹水法制备了抗ZEN的单克隆抗体,对其免疫学特性进行鉴定,进一步组装了ZEN ELISA快速检测试剂盒、ZEN胶体金免疫层析试纸及同步检测赭曲霉毒素A(OTA)及ZEN的胶体金免疫层析试纸,主要实验分析及结果如下。1.ZEN人工抗原的制备根据ZEN的结构特点,将1,4-丁二醇二缩水甘油醚法初次用于ZEN人工抗原的偶联中,制备了人工抗原ZEN-BSA及ZEN-OVA,经紫外光谱法及SDS-PAGE法初步鉴定人工抗原偶联成功。免疫6只小鼠进行人工抗原的免疫原性鉴定,结果5只小鼠产生了ZEN的抗体,从而证明了人工抗原ZEN-BSA制备成功,且具有很好的免疫原性。2.ZEN单克隆抗体的制备与鉴定选择免疫性较好的小鼠,取其脾脏,经细胞融合、亚克隆、ELISA筛选等方法,得到了能稳定分泌ZEN单克隆抗体的杂交瘤细胞株4株,并分别命名为:3G10、4A3-A10、4A3-F9、4F11-H5。经体内诱生腹水法得到了相应的腹水,辛酸硫酸铵法纯化腹水,对单抗进行免疫学特性鉴定,经鉴定4株单抗亚型均为IgG1型;ELISA效价均达到10-5以上;IC50分别为1.2972ng/m L、1.1657ng/m L、1.1149 ng/m L、1.3091 ng/mL;亲和常数分别为4.5×1010L/mol、9.21×1010 L/mol、3×1011 L/mol和6.5×1010 L/mol;经抗体特异性鉴定,结果显示4A3-F9抗体特异性较好,与ZAN有53.121%的交叉,与另外4种结构类似物的交叉反应率都小于4%;另外3株单抗与ZAN交叉反应在75.945%-93.569%,与另外4种结构类似物的交叉反应率都小于10%;4株单抗与常见真菌毒素和载体蛋白的交叉反应率都小于0.02%。3.玉米赤霉烯酮ELISA快速检测试剂盒的研制利用ZEN单克隆抗体4A3-F9研制了ZEN ELISA快速检测试剂盒。试剂盒经优化后,标准曲线线性良好,回归方程为:y=-0.5636x+0.5706,R~2=0.9922,检测限为0.2761ng/m L,IC50为1.3315ng/mL,试剂盒的检测范围在0.2761-6.8362 ng/mL,批内、批间变异系数均在10%以下,室温可稳定保存1年以上,具有良好的精密度及稳定性。选用75%的甲醇为提取液,在玉米及饲料中的平均回收率大于90%,检测限为3.3132μg/kg。综上所述,该ZEN ELISA检测试剂盒可以用于谷物及饲料中ZEN污染的检测。4.玉米赤霉烯酮胶体金免疫层析试纸的研制利用ZEN单克隆抗体4A3-F9组装ZEN胶体金免疫层析试纸,并对试纸进行参数优化和性能鉴定。经鉴定ZEN试纸的目测灵敏度为20 ng/m L;借助BioDot-TSR3000读条仪进行ZEN的定量检测,扫描不同ZEN浓度的试纸检测线灰度值绘制标准曲线,得到的线性回归方程为y=-0.6536x+0.8526,R~2=0.9898,经计算,试纸定量检测的IC50为3.4632ng/m L,检测限为0.8462 ng/mL。玉米样品中添加回收率为91.30%-97.07%,批内最大变异系数为5.32%,批间最大变异系数为4.84%,批内、批间变异系数均小于10%;经加速稳定试验证明,该试纸室温可稳定保存1年以上;并通过与HPLC法确证,本试验制备的ZEN胶体金免疫层析试纸可以用于天然样品中ZEN污染物的检测,且具有较高的准确性。5.同步检测赭曲霉毒素A及玉米赤霉烯酮的胶体金免疫层析试纸的研制本试验在ZEN胶体金免疫层析试纸的基础上结合OTA单克隆抗体,研制了一种能同步、半定量及定量检测玉米、其他谷物及其制品中OTA及ZEN污染物的胶体金免疫层析试纸。结果显示,该试纸检测OTA及ZEN的目测灵敏度分别为6 ng/m L和20 ng/mL,借助TSR3000读条仪可以实现定量检测,其对OTA及ZEN的IC50分别为1.7905 ng/m L和4.3514 ng/m L,检测限分别为0.7697 ng/mL和1.2000 ng/mL。用该试纸检测天然玉米样品,并与HPLC检测结果比对,显示两种检测方法有很好的相关性,该试纸可以用于同时、快速、半定量及定量检测玉米中OTA及ZEN的污染。
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S859.8
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，本文编号：1333905
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