凡纳滨对虾丝氨酸蛋白酶抑制因子（Serpins）的鉴定及调控功能研究

发布时间：2017-12-26 13:10

本文关键词：凡纳滨对虾丝氨酸蛋白酶抑制因子（Serpins）的鉴定及调控功能研究　出处：《西北农林科技大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：凡纳滨对虾,也称之为南美白对虾,是我国重要的养殖虾类。近年来,由于疾病频频爆发,我国乃至全球对虾养殖产业都遭受了巨大损失。因此,在加强病害防治的同时,更要加大对虾基础免疫的研究,为对虾抗病育种奠定分子基础。作为低等的无脊椎动物,凡纳滨对虾只能依赖于先天免疫系统来抵御病原的入侵。病原入侵后激活Toll/IMD通路以及酚氧化酶原系统,通过诱导产生抗菌肽以及发生黑化反应来杀灭病原。在这些免疫应激反应被激活的过程中,都需要丝氨酸蛋白酶的参与。然而,过多被激活的蛋白酶会对机体自身造成损害,引发对虾死亡,必须加以严格调控,做到按需激活。丝氨酸蛋白酶抑制因子serpin,能够通过对蛋白酶的特异性抑制,进而有效调控蛋白酶激活。本研究利用同源克隆结合网络数据、RACE技术,从凡纳滨对虾分离鉴定出4种serpin基因,并对其进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR技术,从mRNA水平对4个serpin基因的表达谱进行分析;构建EGFP融合表达质粒,转染果蝇S2细胞,分析serpin基因的亚细胞定位;过表达serpin基因,利用双荧光素酶报告基因系统,检测serpin基因对抗菌肽启动子活性的影响;体外合成双链RNA,利用RNA干扰技术沉默serpins表达后,探究其与通路相关基因的表达调控关系;构建原核表达载体,诱导表达、纯化得到4个serpin基因的重组蛋白,进行体外活性分析;定点突变serpinB3 P1P1’位点,分析P1P1’位点对蛋白酶抑制的选择特异性;利用GST Pull-down技术,检测与serpinB3结合的靶蛋白;利用抗体杂交进一步分析serpinB3与蛋白酶的作用机制,获得的主要研究结果如下:1.利用同源克隆和RACE技术从凡纳滨对虾克隆得到四个serpin基因,分别命名为Lvserpin3、Lvserpin7、Lvserpin8、LvserpinB3。四个serpin基因都含有信号肽序列、serpin结构域、反应中心环(RCL)以及典型的7-8个α-螺旋以及3个β-折叠,其中,LvserpinB3在其N末端具有一个跨膜结构域。2.共聚焦显微观测结果显示,与EGFP组相比,Lvserpin3定位在整个细胞,LvserpinB3主要定位在线粒体。在果蝇S2细胞过表达Lvserpin3,引起果蝇抗菌肽Attacin A启动子活性显著降低,过表达LvserpinB3后引起凡纳滨对虾抗菌肽Penaeidin4启动子活性显著下降。对启动子活性的抑制表明Lvserpin3和LvserpinB3能够参与对一些抗菌肽生成的调控,进而参与到对虾的抗菌免疫。3.凡纳滨对虾lvserpin3、lvserpin8和lvserpinb3在肝胰腺中表达量最高,lvserpin7在血细胞中表达量最高;在注射鳗弧菌后,lvserpin3基因的mrna表达量在感染早期显著上调,lvserpin7、lvserpin8及lvserpinb3在感染的后期,表达量极显著高于对照组。在注射溶壁微球菌后,lvserpin3和lvserpin7基因的mrna表达量在感染早期显著上调,而lvserpin8及lvserpinb3在感染的后期表达量显著上调。在注射wssv中后期,lvserpin3、lvserpin7、lvserpin8及lvserpinb3表达量都有显著地上调。利用dsrna干扰技术沉默lvserpin3表达后感染鳗弧菌,引起酚氧化酶原激活因子(lvppaf)和酚氧化酶原(lvpropo)的mrna表达量显著上调,血液酚氧化酶活力(po)显著上升;沉默lvserpin7后,lvppaf和酚氧化酶原激酶(lvppae)的mrna表达量显著上升;沉默lvserpin8后,酚氧化酶原激酶2(lvppae2)的mrna表达量显著上升;沉默lvserpinb3后,丝氨酸蛋白酶1(lvsp1)和lvppae2的mrna表达量显著增加。此外,沉默4个serpin都引起对虾累积死亡率显著上升。4.利用纯化得到的重组serpins蛋白进行体外抑制实验。rlvserpin3对枯草芽孢杆菌和鳗弧菌的结合活力很强,而对溶壁微球菌和大肠杆菌的结合活力较弱。而且,rlvserpin3蛋白能够通过对枯草芽孢杆菌和溶壁微球菌所分泌的蛋白酶的有效抑制进而抑制它们的生长。rlvserpin7不仅表现出对枯草芽孢杆菌和鳗弧菌强的结合活力,而且对枯草芽孢杆菌分泌的蛋白酶有显著的抑制作用。rlvserpin8蛋白对牛胰蛋白酶有显著的抑制效果。rlvserpinb3蛋白对胰蛋白酶、弹性蛋白酶以及木瓜蛋白酶都有显著的抑制效果。除此之外,rlvserpin3、rlvserpin7、rlvserpin8和rlvserpinb3蛋白能抑制酚氧化酶原反应的激活。5.突变第373位氨基酸(p1位点)r为g后,rlvserpinb3对胰蛋白酶的抑制活性有显著的降低;突变第374位氨基酸(p1’位点)i为g后,rlvserpinb3对胰蛋白酶的抑制活性有所下降,但与野生型相比抑制活性没有显著差异;而在同时突变373/374位氨基酸(p1p1’位点)ri为gg后,rlvserpinb3对胰蛋白酶的抑制活性显著降低。gstpull-down检测到rlvserpinb3蛋白能够下拉与其拥有相同p1p1’激活位点的rlvsp1蛋白。这就表明serpin能够通过识别具有相同p1p1’位点的蛋白酶而发挥抑制作用,改变p1p1’位点后,对蛋白酶的抑制效果不同,进一步表明serpin基因的p1位点对蛋白酶的抑制有选择特异性。对rlvserpinb3与蛋白酶反应物的westernblot检测结果显示,rlvserpinb3未与蛋白酶结合形成的大分子条带,而是被降解形成小片段分子,而且随着rlvserpinb3蛋白浓度的加大,小片段分子的浓度也相应的增加。上述研究结果表明,不同serpin基因在对虾机体中发挥的作用各不相同,或者是通过调节抗菌肽的产生,或者是通过对细菌蛋白酶以及参与酚氧化酶原系统激活的蛋白酶的抑制来参与到对虾机体防御中。通过对候选基因serpin的免疫调控研究,并以此作为选育指标,将为凡纳滨对虾的抗病育种提供一定的理论依据。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S917.4

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