新城疫病毒HN基因重组乳酸菌抗小鼠结肠癌及免疫机制的初步研究

发布时间：2017-12-26 12:34

本文关键词：新城疫病毒HN基因重组乳酸菌抗小鼠结肠癌及免疫机制的初步研究　出处：《吉林大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：结肠癌是一种常见的高发性消化道癌症，结肠癌因肿瘤本身及患病机体年龄、营养状况等因素而常发生免疫抑制。结肠癌潜在的免疫原性和机体的免疫反应会影响机体的生存时间。因此，任何能够提高肿瘤免疫原性、激发或重塑机体免疫系统、阻止机体免疫抑制的出现，都将有助于排斥或摧毁肿瘤细胞，是癌症免疫治疗的重要策略。新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）囊膜表面的血凝素神经氨酸酶蛋白（HN）是病毒感染入侵宿主的重要工具，也是病毒发挥抗肿瘤作用的重要功能蛋白。随着乳酸菌原核表达系统的发展成熟，乳酸菌已成为功能蛋白基因的重要运载工具，在介导消化道局部免疫，影响全身性免疫调节方面具有突出的益生优势。其中乳酸杆菌以其特有的免疫刺激活性和对肠黏膜的持续黏附活性，逐渐成为一类重要的工程菌株替代其他益生菌株。为此，本研究克隆了NDV HN基因，利用实验室成功改造可锚定表达于细胞膜的乳酸菌表达载体pSIP409，构建HN-pSIP409重组体，采用电转化技术，将HN-pSIP409重组体电转化到受体菌-植物乳杆菌（Lactobacillus plantanrumNC8）感受态中。利用SDS-PAGE和免疫印迹，检测HN蛋白的表达情况。为明确HN蛋白表达位置，采用流式细胞术检测了重组菌菌体细胞表面HN蛋白的表达情况。为便于检测重组菌的稳定性，在HN基因下游插入了绿色荧光蛋白（GFP）基因，构建了具有荧光效应的HN基因重组乳酸菌，通过菌体荧光效应检测GFP基因的表达情况及重组菌的稳定性。结果成功构建了新城疫病毒HN基因重组乳酸菌（简称重组菌），SDS-PAGE、Western blotting检测可见在66kDa附近有免疫印迹条带，表明表达的HN蛋白具有反应原性；流式检测结果表明HN蛋白可以表达于菌体细胞表面，有利于与肠黏膜表面接触和刺激树突状细胞活化。稳定性检测结果表明串联表达GFP基因的重组菌传30代依然可见其荧光效应。研究显示，经常饮食乳酸菌发酵的乳制品常与结肠癌低发生率有密切联系。尽管目前尚无明确机制的研究，但很多研究已证实乳酸菌能够诱导肿瘤细胞凋亡、阻断致癌物诱变作用及诱导机体产生抗肿瘤免疫效应，因而在预防或抑制肿瘤发生方面具有重要的研究意义。而新城疫病毒HN蛋白分子除了能吸附和水解肿瘤细胞表面的唾液酸受体，更重要的是能够激活及增强固有免疫以防御肿瘤。为明确HN蛋白能否协同增强乳酸菌的抗肿瘤功能，我们提前2周给荷瘤鼠分别灌胃109CFU的重组菌（命名为HN/Lab）和植物乳杆菌（Lactobacillusplantanrum NC8，命名为L.p）。此后，通过肿瘤诱导建立了皮下结肠癌移植瘤、原位移植瘤及肠外肺转移瘤模型，并在肿瘤诱导后每周加强免疫1次、连续免疫3周，评价重组菌抗肿瘤效果如下：（1）通过评估重组菌对皮下移植瘤的抑瘤效果，我们检测到了重组菌HN/Lab（CT26+HN/Lab组）能明显抑制荷瘤鼠皮下肿瘤的生长，与模型组（CT26组）相比，分别在肿瘤诱导后25d、30d差异显著（p0.05），小鼠的存活率和生存时间也显著高于CT26组（p0.05）；肿瘤病理组织学检测显示重组菌HN/Lab处理组小鼠肿瘤组织淋巴细胞浸润明显。植物乳杆菌组（CT26+L.p组）小鼠在肿瘤诱导25天后，其抑瘤效果没有CT26+HN/Lab组明显。（2）监测重组菌对小鼠原位结肠癌移植瘤的抑制效果，结果显示重组菌HN/Lab在肿瘤诱导后7d即能明显抑制肿瘤的生长（p0.05），而植物乳杆菌也有抑制作用但未达到差异显著水平；经初步计算重组菌HN/Lab抑瘤率为43.13%，与植物乳杆菌23.03%抑瘤率相比有了明显的提高；肠道肿瘤病理组织学检测结果显示重组菌HN/Lab诱导肿瘤坏死明显、且浸润的淋巴细胞也显著增多，能够抑制肿瘤细胞向黏膜层方向转移，肠道病理评分明显降低。（3）通过比较肠外肺转移模型肺脏肿瘤结节数量，表明CT26+HN/Lab和CT26+L.p组肺脏肿瘤结节数量均明显降低，其中重组菌组与模型组相比差异显著，表明重组菌HN/Lab对结肠癌细胞的转移具有一定的抑制作用。通过检测重组菌的抑瘤效果，我们发现无论重组菌和植物乳杆菌（受体菌）是否与肿瘤细胞有直接的接触，它们对肿瘤细胞的生长都有抑制作用，说明它们可能是通过影响机体的免疫反应发挥了作用。研究已经证实HN蛋白能够有效的刺激I型IFN（IFN-、IFN-β和TNF-）的产生和释放从而激活NK细胞的杀伤活性，且这种活性的发挥可以不依赖病毒的复制。而单独口服乳酸菌后能够有效地诱导DCs的活化，促进DCs的成熟，从而产生两方面效应：一方面激活NK细胞，NK细胞即可产生杀伤肿瘤效应，后者通过分泌IFN-γ等细胞因子又会进一步活化DCs，形成一个紧密的cross talk；另一方面，活化DCs还会调节Th细胞的分化，影响（可能抑制或促进）肿瘤生长，分化的趋势与菌株个体有着密切的联系。因此我们推测重组菌主要通过诱导机体产生抗肿瘤免疫而发挥作用。为进一步验证我们的假设，本研究采用流式细胞术、ELISA及免疫组化等技术检测了重组菌对NK细胞活化及杀伤效应的影响，评估了重组菌诱导DCs的活化以及对CD4+T、CD8+T淋巴细胞相对数量、分化及杀伤活性的影响，并检测了重组菌对肿瘤免疫微环境的影响，即检测了结肠癌荷瘤鼠肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）种类、相对数量及杀伤活性的影响，结果如下：（1）采用ELISA检测在肿瘤诱导前后，灌服重组菌HN/Lab均能够促进脾脏中I型细胞因子包括IFN-γ和TFN-的表达，提高脾脏中NK细胞的比例及提高NK细胞中IFN-γ和颗粒霉素B的分泌，体外杀伤实验表明NK细胞对靶细胞的杀伤活性也得到显著提高。表明重组菌能够诱导NK细胞的增殖及活化，发挥抗肿瘤作用。（2）流式细胞术检测到重组菌可以提高脾脏中CD4+T细胞的比例（p0.05），对CD8+T细胞的比例影响并不明显，表明重组菌主要诱导以Th细胞为主的反应。为进一步研究Th细胞的极化，我们首先检测重组菌对DCs活化的影响，，结果表明，重组菌可以促进B7分子CD80和CD86的表达而介导DCs的成熟分化，且成熟的DCs与CD4+T细胞共培养后可上调Th1型细胞因子IFN-γ的表达，而对IL-4（Th2型）或IL-17（Th17型）表达影响并不显著，说明重组菌主要诱导CD4+T细胞向Th1方向极化而发挥抗肿瘤作用。尽管重组菌没有明显提高CD8+T细胞的相对数量，但促进了CD8+T分泌IFN-γ和颗粒霉素B的数量（p0.05），而植物乳杆菌主要促进CD8+T分泌IFN-γ，说明重组菌可以显著提高CD8+T细胞杀伤活性，有利于产生抑瘤效应。（3）流式细胞术及免疫组化结果表明，重组菌能够提高肿瘤组织中浸润的CD8+T细胞及NK细胞比例，其中NK细胞数量显著增多（p0.05），特别是明显提高分泌颗粒霉素B的CD8+T细胞及NK细胞的比例（p0.05），表明重组菌HN/Lab能够促进CD8+T细胞、NK细胞向肿瘤组织迁移并提高其杀伤活性，而改变肿瘤组织微环境，抑制肿瘤细胞生长。综上，本研究构建了表达新城疫病毒HN基因的重组乳酸菌，其对建立的鼠结肠癌实验模型具有较好的抑制作用，且主要通过促进NK细胞的增殖和活化、诱导DCs成熟、促进CD4+Th1分化、提高CD8+T细胞杀伤活性以及促进上述免疫活性细胞向肿瘤组织浸润，而发挥了综合抗肿瘤免疫效应。为重组乳酸菌诱导的抗肿瘤免疫及其机制的深入研究奠定基础。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S857.4

【参考文献】