转基因抗病虫与高赖氨酸水稻的改良研究

发布时间：2017-12-29 10:18

本文关键词：转基因抗病虫与高赖氨酸水稻的改良研究　出处：《浙江大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：水稻是最重要的粮食作物之一,同时也是世界超过一半人口的主粮。然而近些年来,水稻病虫害严重的影响了水稻的产量,对粮食安全产生巨大的威胁。目前防治水稻病虫害的方法主要是依赖化学杀虫、杀菌剂,虽然在一定程度上控制了其危害的程度,但是化学喷施同时造成了严重的环境污染,而且费时费力,因此急需替代的方法。与此同时,由于长年以来人们对杂交水稻产量的过分关注,在一定程度上忽略了杂交水稻品质的改良,使得商品粮的稻米品质长期停滞不前。因此,综合改良水稻产量、品质以及抗性等性状已迫在眉睫。随着植物分子生物学的发展,使得通过植物基因工程手段来改良水稻病虫害抗性及稻米品质成为了可能。本研究利用常规杂交及分子标记辅助选择的方法,对含转Bt (crylAb/lAc)基因光温敏雄性不育系208S进行了抗虫蛋白含量的检测及其后代Bt基因拷贝数的分析,并考察了其杂种后代的农艺性状表现。为了改良该不育系的稻瘟病抗性,本研究将208S与聚合了抗稻瘟病基因Pi1、Pi2的恢复系材料华1517B进行杂交转育,获得了聚合Pi1、Pi2的改良材料。在稻米品质改良方面,本研究对转LYSINE-RICH PROTEIN (LRP)基因材料PA110及其后代进行了遗传稳定性及稻米氨基酸含量检测分析,初步研究了该基因增加种子中赖氨酸含量的分子遗传机理。同时通过传统回交转育并结合分子标记辅助选择的方法将LRP基因导入到水稻品种9311中,使得赖氨酸等必需氨基酸得到一定程度提高,改良了稻米的营养品质。本研究的主要研究结果与结论如下：(1)随着植株生长发育,不育系材料208S及其杂种浙优3号中Cry1Ab/1Ac蛋白含量呈现逐步下降的趋势；在叶片及茎秆中,Cry1Ab/1Ac蛋白的丰度要显著高于其在胚乳及根部中的丰度；在所检测的各个生长阶段及不同组织中,Cry1Ab/1Ac蛋白的含量与其供体亲本华恢1号(又名TT51)中的含量处于相同水平；cry1Ab/1Ac基因在不同遗传背景下均可以稳定表达,同时其在纯合及杂合状态下并没有出现显著的剂量效应。(2) Southern blot转基因拷贝数检测显示,208S及其杂种后代浙优3号、浙优5号及02567同供体亲本TT51一样,均为中cry1Ab/1Ac基因双拷贝材料。(3)不育系材料208S配组的三个材料产量均表现良好,其中浙优3号及浙优5号优于南方稻区的主栽品种丰两优4号；208S及浙优3号的绝大多数品质性状均达到或超过国标优质米一级标准。(4)利用MAS及回交育种手段,将水稻材料华1517B中的抗稻瘟病基因Pi1、Pi2成功导入到不育系208S中,获得了聚合Pi1、Pi2的改良材料。利用基因组中平均分布的并且在亲本间(208S、华1517B)具有多态性的120个分子标记,对改良株系进行了遗传背景回复情况分析。结果表明,通过杂交及三次的回交,待改良单株材料的背景回复率已经达到96.7%,主要农艺性状与亲本208S无显著性差异。在育性方面,改良材料在夏季杭州表现出完全的不育状态,而在冬季海南则表现出部分可育状态,与亲本208S表现一致,同时该材料主要农艺性状也与亲本208S无显著差异。(5) 改良稻瘟病抗性的株系在湖北省恩施市国家稻瘟病鉴定点表现为4级中度抗性,显著的优于亲本对照208S(7级)；改良稻瘟病抗性株系在海南三亚试验田表现出对稻纵卷叶螟表现出完全的抗性,并与亲本对照208S的抗虫表现一致。(6) 定量qRT-PCR检测LRP基因的表达模式后发现,LRP基因在转基因水稻叶片中的表达量极低；随着灌浆时间的增加,胚乳中LRP基因的表达量急剧增加,说明LRP基因在PA110不同组织中表达量的变化情况与其Gtl启动子的表达模式一致。在PA110胚乳中,外源的LRP基因对整个天冬氨酸代谢途径相关酶基因均产生了一定影响；结果同时显示,PA110胚乳中赖氨酸分解代谢的减少,可能导致总的赖氨酸含量较对照显著的增加；对9个水稻种子贮藏蛋白相关基因进行表达量分析后发现,这些基因的表达量随着胚乳的发育呈现上升表达趋势,但是在PA110中,这些基因表达量的上升幅度并没有在对照品种中上升的幅度大。(7)在PA110种子中,包括赖氨酸在内的几乎所有氨基酸含量较对照均有一定程度提升,其中赖氨酸含量在糙米和精米中较对照分别提升了30.1%和28.0%,总氨基酸含量分别提升了21.3%和22.4%；在PA110叶片中,随着植株的生长发育,各个游离氨基酸含量呈现上升趋势；在成熟期,PA110中所有游离氨基酸含量均较对照有了明显增加,其中赖氨酸增加幅度显著。(8)在LRP基因导入材料9311LRP中后,赖氨酸含量较对照仅有7.3%的增加,而其它大部分氨基酸含量均有小幅度的降低,说明LRP基因在不同的遗传背景条件下对提升赖氨酸的作用会有所差异；在PA110与9311的杂交衍生系中,糙米中的赖氨酸含量较杂种对照提升明显(19.6%),而在PA64S与9311LRP的杂交衍生系中,糙米的赖氨酸含量较杂种对照出现了2.4%的降低,说明LRP基因在应用到杂交水稻的过程中,其在不育系背景中的表现可能会比其在恢复系背景中更有应用潜力；在PA110与9311LRP的杂交衍生系中,虽然LRP基因型为纯合状态,然而在糙米中赖氨酸含量较杂种对照仅有9.2%的增加,说明LRP基因处于杂合状态可能对提高杂种种子中赖氨酸含量更具应用潜力。(9)转基因材料PA110的株高与对照相比有着较明显的降低,同时,PA110自交种子的千粒重及种子发芽率也较对照有着显著的下降；对PA110成熟阶段花粉进行电镜观察后发现,PA110中的外源LRP基因并未对不育系水稻的育性产生明显影响；PAl 10衍生系9311LRP与对照9311在株高、每穗粒数、千粒重、种子萌发率等农艺性状方面存在一定负面效应,说明在9311背景下,种子胚乳中表达外源LRP基因可能会影响种子的灌浆充实度,并影响种子萌发；在杂交种PA110/9311(LRP杂合基因型)中,包括千粒重在内的其他主要农艺性状均没有发生显著变化,说明杂种优势可能在一定程度上互补了PA110中农艺性状的负面效应。然而PA64S/9311LRP(LRP杂合基因型)较对照表现出千粒重的显著下降；LRP纯合基因型的组合PA110/9311LRP也表现出千粒重较对照的显著下降；以上结果表明,外源LRP基因在不同水稻遗传背景下对水稻农艺性状的影响存在一定的差异；在不育系中适度表达LRP基因,并获得的杂交品系在改良杂种赖氨酸含量方面更具有应用的价值。(10)利用MAS结合传统杂交的方法,获得了聚合crylAc及LRP基因的改良材料9311LRP/crylAc;聚合材料表现出对稻纵卷叶螟及二化螟良好的抗性,说明LRP基因并不会影响crylAc基因对螟虫的抗性表现；但聚合材料种子中赖氨酸的含量显著的低于在9311LRP中的含量,说明cry1Ac基因可能影响LRP基因发挥其在种子中积累赖氨酸的效应。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S511

【参考文献】