薄皮甜瓜果实成熟品质形成与蛋白质组学分析

发布时间：2017-12-29 20:14

  本文关键词：薄皮甜瓜果实成熟品质形成与蛋白质组学分析　出处：《沈阳农业大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

  更多相关文章： 薄皮甜瓜 iTRAQ 蛋白质组 果实成熟 品质 Western-blot

【摘要】：薄皮甜瓜(Cucumis melo var.makuwa Makino)在中国广泛栽培,甜脆多汁、香气浓郁,深受大众喜爱。在薄皮甜瓜成熟过程中,质地、颜色、糖、风味和香气等受到多种因素调控而发生变化,涉及大量生理生化变化和基因表达,影响果实的品质。通过蛋白质组学技术研究果实成熟过程中的生理生化变化,有利于更好地理解薄皮甜瓜成熟过程中关键蛋白质对品质形成的作用。本试验以薄皮甜瓜'玉美人'花后5,15,25和35 d的果实为试材,通过测定果实单果重、硬度、色度、可溶性固形物(SSC)、香气物质、糖含量和内源乙烯释放量等品质和生理指标,研究薄皮甜瓜果实成熟过程中生理生化特性的变化;利用iTRAQ蛋白质组学技术研究薄皮甜瓜成熟过程中4个不同成熟阶段的差异蛋白,获得与果实品质相关的重要蛋白;分别从基因表达、酶活性和Western-blot蛋白半定量三个方面验证α-亚麻酸代谢、淀粉及蔗糖代谢和糖酵解途径中关键差异蛋白脂氧合酶(Lipoxygenase,LOX),醇脱氢酶(Alcohol dehydeogenase,ADH),醇酰基转移酶(Alchol acyl transferase,AAT),蔗糖合成酶(Sucrose synthetase,SS)和蔗糖磷酸合成酶(Sucrose phosphate synthetase,SPS)在蛋白质组学中的表达规律。主要研究结果如下:1.以花后4个不同时期薄皮甜瓜的果实为试材,对果实成熟过程中的生理生化指标进行测定,结果发现在果实成熟过程中,果实硬度先升高后下降,在花后25 d达到最大值,果皮褪绿变黄,果实单果重和可溶性固形物含量显著升高,均在花后35 d达到最大值,乙烯释放量显著升高,表明花后35 d为薄皮甜瓜'玉美人'的生理成熟期。2.通过利用气相色谱-质谱联用和高效液相色谱技术测定不同成熟阶段薄皮甜瓜果实的香气物质和糖含量,结果发现,在果实成熟过程中共鉴定出39种香气物质,包括17种酯类,12种醇类,4种醛类和4种酸类物质。在果实成熟过程中,醛类物质含量无明显变化,酸类物质含量显著下降,醇类和酯类物质含量显著升高,其中酯类物质的种类和含量在花后35 d迅速升高达到峰值,鉴定出的主要酯类物质有乙酸乙酯、2-甲基乙酸丁酯和乙酸己酯等。主成分分析结果表明,酸类物质和酯类物质变化呈负相关,花后5d与15d的果实香气物质相似,主要为酸类、醇类和醛类物质,花后25 d和35 d的果实主要香气物质分别为醇类物质和酯类物质。在甜瓜果实成熟过程中,果糖和葡萄糖积累缓慢且同步,在花后35 d,蔗糖迅速积累达到最大值。3.利用iTRAQ技术对花后4个时期的果实进行蛋白质组研究,共鉴定出5835个蛋白,1694个差异蛋白。根据蛋白质的相对丰度,将差异蛋白聚为4类,分别为花后35,25,15和5 d达到峰值的蛋白。对4类蛋白进行GO功能富集分析,其中第1类蛋白(在35 d达到峰值)主要参与响应逆境胁迫,果实成熟,脂肪酸代谢等过程;第2类蛋白(在25 d达到峰值)参与的生物学过程主要包括响应氧化胁迫,细菌防御,渗透胁迫,甘油醚代谢过程;第3类蛋白(在15d达到峰值)主要参与激素调节,根系发育;第4类蛋白(在5d达到峰值)主要参与DNA复制,rRNA处理,mRNA结合等。4.利用KEGG数据库信息分析差异蛋白质所在的生物学通路及相互关系,筛选出αα-亚麻酸代谢,淀粉及蔗糖代谢,糖酵解三个代谢途径中差异蛋白LOX、ADH、AAT、SS和SPS。在果实成熟过程中,两类LOX蛋白表达变化规律不同,13-LOX蛋白先上调,在25d达到峰值后略下调,9-LOX蛋白显著上调,ADH、AAT、SS和SPS蛋白均显著上调。5.为了验证蛋白质组的结果,利用荧光定量PCR技术对差异蛋白LOX、ADH、AATT、SS和SPS在基因水平进行验证,结果发现,CmLOXs18个基因家族成员在果实成熟过程中表达趋势不同,CmLOX06,CmLOX10-15和CnLOX18与13-LOX蛋白表达模式相同,CmLOX07-09,CmLOX16和CmLOX17与9-LOX蛋白表达模式相同;除了 CmAAT3外,CmAAT1,CmAAT和 与 AAT4 蛋白表达趋势相同;CmSS1和CmSPS1在果实成熟过程中表达量显著升高,与其蛋白表达趋势相同。6.通过测定酶活性,制备CmLOX09、CmLOX18 CmADH2、CmAAT1、CmSS1和CmSPS1的多克隆抗体,对差异蛋白进行酶活性和Western-blot蛋白半定量验证。结果发现,LOX、ADH、AAT、SS和SPS酶活性均与其对应差异蛋白在4个时期的变化规律相一致;CmLOX09蛋白表达量在不同成熟时期变化不明显,在花后35 d表达量略高于其他时期;CmLOX18在花后25 d蛋白表达量急剧增加后,此后在花后35 d逐渐下降;CmADH2蛋白表达丰度不高,在花后25-35 d,表达量有升高的趋势但变化不明显;CmAAT1蛋白仅在花后35 d大量表达;CmSS1和CmSPS1蛋白均在花后35 d维持较高的水平。这6个差异蛋白的Western-blot结果均与蛋白质组学的结果相一致。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S652

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本文编号：1351711